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Cortez, Ma. Fernanda. Gomez, Clarisa. Ortiz, Analía. Pelossso, Rocío. Pili, Agustina. Rivero,Jesica. Roldán, Ana Sol. Sandoval, Facundo. San Juan, Manuela.ESI-MALDI-TOFIntroducciónEspectrometría de masasLa espectrometría de masas es una técnica analítica en la que los átomos omoléculas de una muestra son ionizados, con mayor frecuencia positivamente,separados por su relación masa/carga (m/z) y posteriormente detectados yregistrados.La importancia y proyección de la MS es debida a su potencial analítico. Lasventajas de esta técnica son: proporcionar una alta especificidad en ladeterminación del peso molecular debido a la posibilidad de medirexactamente su masa molecular así como obtener información a partir de losfragmentos iónicos de un analito. Su sensibilidad es muy elevada y en teoría,la MS permite detectar una única molécula. Es muy versátil, ya que permitedeterminar la estructura de tipos de compuestos muy diversos. Es aplicable alos elementos y a todo tipo de muestras, volátiles, no volátiles, polares yapolares, sólidos, líquidos y gases. En combinación con técnicas de separaciónde alta resolución, es la más cualificada para analizar muestras complejasreales.El análisis por espectrometría de masas se realiza en cuatro etapas básicas:1. Introducción de la muestra.2. Ionización de la muestra, en la que se transforman los átomos o moléculasen especies iónicas en fase gaseosa, con la consiguiente pérdida de electroneso protones.3. Separación y el análisis de los iones moleculares y de los fragmentoscargados producidos según su relación m/z.4. Finalmente, se obtiene el espectro de masas, en el que se presenta laabundancia relativa de los iones y fragmentos separados respecto a la relaciónmasa/carga.El espectro resultante es un gráfico que representa la abundancia relativa delos iones producidos (% de abundancia relativa de los iones producidos)respecto de su relación masa/carga (m/z). La señal correspondiente a un iónaparece en forma de varios picos que corresponden a la distribuciónestadística de los distintos isótopos del ión.
Cortez, Ma. Fernanda. Gomez, Clarisa. Ortiz, Analía. Pelossso, Rocío. Pili, Agustina. Rivero,Jesica. Roldán, Ana Sol. Sandoval, Facundo. San Juan, Manuela.ESI: Ionización por electrosprayEs una ionización a presión atmosférica que se aplica a un amplio grupo demuestras y especialmente se utiliza para la caracterización de biomoléculas.En la ionización por electrospray, la muestra disuelta en un disolventeadecuado pasa a través de un capilar metálico, en cuya punta se aplica unpotencial de 3 a 4 KV y una presión de 1 atmósfera. Se produce una finaniebla de gotas de elevada carga y la evaporación del solvente hace queaumente la densidad de carga, produciéndose la desorción en fase gaseosa.Esquema de un sistema de ionización ESI: electrosprayEl análisis por ESI, se puede hacer provocando una ionización positiva onegativa. Se selecciona la polaridad de los iones que se desea analizarmediante el voltaje del capilar. Permite la obtención del ión molecular, y si sedesea obtener una fragmentación, se puede inducir aumentando el voltaje en lapunta del cono del capilar. Este proceso se utiliza con frecuencia enespectrometría de masas en tándem. En muchos casos, se pueden determinarmasas moleculares de macromoléculas con una precisión de 0,005%.La ionización por electrospray constituye la mejor interfaz cuando se acopla lacromatografía de líquidos (LC) o la electroforesis capilar (CE) con MS.MALDI: Ionización por desorción con láser asistida por una matrizEl sistema MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) se realizamediante una radiación láser y con el concurso de una matriz adecuada. Seopera mezclando una disolución de la muestra con una sustancia matriz que seencuentra en mucha mayor proporción que la muestra (10.000:1); la mezcla sedeposita en un dispositivo portamuestras especialmente diseñado para estesistema de ionización. Tras la evaporación del disolvente, los cristales de lamezcla muestra-matriz se irradian con un haz láser de elevada potencia (106Wcm–2) y de pulsos cortos durante algunos nanosegundos que desorben e
Cortez, Ma. Fernanda. Gomez, Clarisa. Ortiz, Analía. Pelossso, Rocío. Pili, Agustina. Rivero,Jesica. Roldán, Ana Sol. Sandoval, Facundo. San Juan, Manuela.ionizan las moléculas de la muestra y la matriz, manteniéndolas en fasegaseosa.Esquema de un sistema de ionización MALDI: desorción con láser, asistidapor una matriz.La clave del éxito del MALDI, se debe a que la matriz es capaz de absorbergran cantidad de energía a la longitud de onda del láser y posteriormente sufreuna relajación, cediendo la energía emitida a las moléculas de la muestra deuna forma controlada, de manera que permite la desorción de las moléculasquedando como iones intactos en fase gaseosa. Se utilizan diferentes tipos dematrices dependiendo de las aplicaciones y de la naturaleza del analito:matrices orgánicas sólidas y líquidas, líquidos iónicos y materialesinorgánicos.La matriz utilizada en el sistema MALDI, juega un papel muy importante enel proceso de ionización de la muestra y tiene dos misiones, la primera esabsorber el fotón de energía procedente del haz láser, la segunda actúa comoun disolvente del analito reduciendo las fuerzas intermoleculares ydisminuyendo la agregación de moléculas de analito al mínimo. Los ionesgenerados mediante MALDI son mayoritariamente moléculas protonadas conuna sola carga, también se forman iones oligoméricos protonados con doble ytriple carga. Además, se forman aductos de las moléculas de la muestra conNa y K , especialmente en muestras de origen biológico. Se pueden formariones con carga negativa.Una matriz debe tener las siguientes características: fuerte absorción deradiación a la longitud de onda del láser. Buena capacidad de mezcla con elanalito, para que se formen unos microcristales bien definidos. Una baja
Cortez, Ma. Fernanda. Gomez, Clarisa. Ortiz, Analía. Pelossso, Rocío. Pili, Agustina. Rivero,Jesica. Roldán, Ana Sol. Sandoval, Facundo. San Juan, Manuela.temperatura de sublimación que permita la formación de forma instantánea deun conjunto matriz-muestra durante la duración del pulso de láser.Participación en algún tipo de reacción fotoquímica, que permita que lasmoléculas de la muestra puedan protonarse o desprotonarse con una elevadaeficacia.Un aspecto crítico que hay que considerar es la preparación de la muestra,tratando de evitar la posibilidad de que se produzca una disgregación entre lasmoléculas del analito y la matriz durante el proceso de cocristalización, lo queconlleva que la preparación no sea homogénea, dando lugar a una señalinadecuada en el analizador.El mecanismo por el que se produce la ionización MALDI no es todavía bienconocido. Se proponen tres mecanismos para explicarlo, el primerocorresponde a un modelo de ionización fotoquímico, el segundo a un modelode ionización «cluster» y el tercero propone un modelo de transferenciapseudoprotónica. En el modelo de ionización fotoquímica, los iones de lamatriz se producen por un proceso de ionización multifotónica y colisión, losiones de las biomoléculas, a su vez, se producen por la protonación odesprotonación entre los iones de la matriz y las biomoléculas durante unproceso de colisión en fase gaseosa. En el modelo que propone una ionización«cluster» (asociaciones entre iones de muestra y moléculas del disolvente) seconsidera que la radiación láser provoca la desorción de los «cluster», lo quehace que se produzcan los iones de las biomoléculas por desolvatación de lasmoléculas de la matriz. En el modelo que propone una pseudotransferencia deprotones, los iones de biomoléculas se producirían durante un proceso decocristalización de la matriz, tras la absorción de la radiación láser.TOF: Analizador de tiempo de vueloEs uno de los analizadores más sencillos. El principio de los espectrómetrosde tiempo de vuelo (time of flight) se basa en la relación entre la masa y lavelocidad de los iones. Da una medida muy precisa del período de tiempodesde la aceleración de los iones en la fuente (source) hasta que impactan conel detector. Se mide el tiempo que necesitan los iones acelerados para recorreruna distancia (L), sin que los iones estén sometidos a un campo eléctrico y/omagnético.Las prestaciones del TOF son especialmente interesantes, sobre todo encuánto a la resolución y la exactitud en la determinación de la masa ya que seconsiguen valores inferiores a partes por millón.Se han incorporado algunos elementos en el instrumento como son unosespejos electrostáticos denominados «reflectrón» para aumentar la resolucióny mejorar la separación de los haces de iones.
Cortez, Ma. Fernanda. Gomez, Clarisa. Ortiz, Analía. Pelossso, Rocío. Pili, Agustina. Rivero,Jesica. Roldán, Ana Sol. Sandoval, Facundo. San Juan, Manuela.Los equipos MALDI-TOF son muy utilizados para el análisis debiomoléculas, siendo sus principales ventajas:* Análisis muy rápidos, algunos instrumentos que se encuentran en elmercado pueden procesar cien muestras en menos de diez minutos.* Permite la determinación de masas en un amplio intervalo, se pueden medirdesde péptidos de pequeña masa hasta proteínas mayores de 100.000 Dalton(Da).* Se obtienen espectros de masas sencillos, debido a que la mayoría de losiones tienen una carga única, sólo un pequeño porcentaje es de doble carga yrara vez se observan iones de triple carga.* Posibilidad de obtener una imagen espacial molecular o incluso de un tejido,debido a que el haz de radiación láser se puede enfocar en un pocillo muyestrecho (5 μm). También depende de las lentes focalizadoras utilizadas en elequipo MALDI-TOF.* Una sensibilidad muy elevada que puede llegar a detectar cantidades delorden de atomoles de péptidos de pequeño tamaño.Las limitaciones del MALDI-TOF son:* Baja reproducibilidad debido a la dificultad para controlar el proceso decristalización y la producción de iones debido a la fuerte influencia del láser.* Una relativamente baja resolución para la determinación de las masas,debido a que la energía de las biomoléculas se dispersa durante el proceso dedesorción, así como, a la posible unión a la matriz y a la posiblefragmentación de la biomolécula.Por sus características, este equipo está dedicado al análisis de biomoléculas(drogas, metabolitos, oligosacáridos, oligonucleótidos, péptidos y proteinas).Respecto a las proteinas, el MALDI-TOF puede proporcionar informaciónestructural a escala de masa molecular, mapa de péptidos y estructuraprimária, secuencias y modificaciones co.es/servicios/scai/pdf/identificacion de proteinas.pdf
Cortez, Ma. Fernanda. Gomez, Clarisa. Ortiz, Analía. Pelossso, Rocío. Pili, Agustina. Rivero,Jesica. Roldán, Ana Sol. Sandoval, Facundo. San Juan, al Chemistry/Instrumental Analysis/Mass Spectrometry/MALDI-TOF#
Espectrometría de masas La espectrometría de masas es una técnica analítica en la que los átomos o moléculas de una muestra son ionizados, con mayor frecuencia positivamente, separados por su relación masa/carga (m/z) y posteriormente detectados y registrados. La importancia y proyección de la MS es debida a su potencial analítico. Las
