WIXLIB

REVISTAMEXICANADE CIENCIASla cual permaneció 30 segundos, transcurrido este tiempo seencendió la lámpara y se levantó la caja, permitiendo que elanimal explorara libremente la superficie del laberinto, en elmomento en que el animal encontró la caja de escape y entró,la luz fue apagada, permitiendo que el sujeto de permaneciera15 segundos dentro de ella, el tiempo máximo para encontrarla caja escape fue 120 segundos. En esta fase de la prueba seregistró el tiempo de latencia, que fue el tiempo que transcurriódesde que se levantó la caja de “inicio” hasta que el roedorencontró el agujero que tenía la caja de escape y entró enella. Posteriormente el animal regresó a su caja de cautiveriodonde permaneció hasta la siguiente sesión, el tiempo entrelas sesiones fue de 20 min, cada animal recibió tres sesionesde adquisición el mismo día, la caja de escape permaneciósiempre en el mismo agujero. La sesión de recuperación de lainformación se realizó 24 horas después, siguiendo el mismoprocedimiento, se registró el tiempo de latencia de entrada ala caja de escape.Pruebas bioquímicasDespués de la prueba conductual, todos los animalesfueron decapitados y se extrajo el hipocampo completo.En microtubos que contenían 100 μL de PBS 50 mM(pH 7.4) con EDTA 1 mM, se agregaron 20 mg el tejidonervioso, se centrifugaron a 12,000 rpm durante 30 mina 4 C, en una microcentrífuga refrigerada (Hettich Mikro200R). Se recuperaron los sobrenadantes y se mantuvierona -20 C hasta el día en que se determinó la actividadenzimática. Las reacciones colorimétricas fueron leídas en unespectrofotómetro Varian Cary 50 UV-Vis, todas las muestrasfueron procesadas por duplicado.Determinación de la actividad enzimática de la superóxidodismutasa (SOD)La actividad enzimática de la SOD fue determinada con unkit de diagnóstico RANSOD (RANDOX Laboratories). Lafunción de la superóxido dismutasa es acelerar la dismutacióndel radical tóxico superóxido (O2 -) en peróxido de hidrógenoy oxígeno molecular. Este método emplea xantina y xantinaoxidasa (XOD) para formar radicales superóxido, los cualesreaccionan con el cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenol)5-fenil tetrazolio (INT) para producir formazán rojo, laactividad de la SOD se mide por el grado de inhibición deesta reacción.17 Se colocaron 25 μL del sobrenadante de lasmuestras previamente obtenidas, se adicionaron 850 μL delsustrato mixto y 125 µL de xantina oxidasa. Al cabo de 30segundos se realizó la lectura de la absorbancia inicial a 505nm (A1) y 3 minutos después la absorbancia final (A2), secalculó el incremento de la absorbancia por minuto para cadamuestra. Toda la reacción se llevó a cabo a 37 C. Se realizóla curva de calibración de la SOD con el programa GraphPadFARMACÉUTICASPrism 6 usando diluciones del patrón proporcionadas en elkit, la concentración mínima detectable de SOD fue 2.2 U/mgde tejido.Determinación de la actividad enzimática de la glutatiónperoxidasa (GPx)La GPx cataliza la reducción del peróxido de hidrogeno (H2O2)a alcoholes estables (R-OH) y agua, usando al glutatión celularcomo el agente reductor.18 La actividad enzimática de GPxexpresada en mmol/min/mg del tejido, se determinó usandoel kit de ensayo de actividad celular Glutatión peroxidasa(Sigma-Aldrich ). El método utiliza una determinaciónindirecta y se basa en la reacción de oxidación que sufre elglutatión (GSH) a glutatión oxidado (GSSG) catalizada porla GPx. La reacción entre GSSG y NADPH (nicotinamidaadenina dinucleótido fosfato reducido) en presencia de laglutatión reductasa (GR) da como resultado GSH y NADP en su forma oxidada. La disminución de la absorbancia,medida a 340 nm, durante la oxidación de NADPH a NADP indica la actividad de la GPx.Se prepararon microtubos para el control positivo y para lasmuestras los cuales contenían 50 μL 5mM de NADPH más890 μL de buffer de GPx, a los microtubos del blanco seles adicionó 940 μL de buffer. A los microtubos del controlpositivo se les adicionó 50 μL de la enzima y a los de lasmuestras 50 μL del sobrenadante. Se mezclaron por inversión,la reacción inició con la adición de 10 μL de la solución 30mM terc-butil hidroperóxido. Nuevamente se mezcló porinversión y a los 60 segundos se realizó la lectura a 340 nm.Determinación de la actividad enzimática de la catalasa(CAT)La CAT descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en aguay oxígeno.19 La actividad enzimática de la CAT expresada enµmol/min/mg del tejido, fue determinada usando el kit deactividad Catalasa (Sigma-Aldrich ). Una unidad de catalasadescompone 1 µmol de H2O2 por minuto a pH 7.0 a 25 C enun sustrato de 50 mM de H2O2.La reacción enzimática se realizó en microtubos en los que semezclaron 20 μL del sobrenadante de las muestras y 75 μL delbuffer que contiene 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.0), parael blanco solo se agregó el buffer. La reacción inició cuandose agregaron 25 μL de la solución colorimétrica (200 mMH2O2), se mezcló por inversión y se incubó durante 5 mina 25 C. Posteriormente se agregaron 900 μL de la soluciónstop, que contiene 15 mM de azida de sodio en agua. Setomaron 10 μL de la reacción enzimática y se añadió 1 mLde la solución cromógena, compuesta por 150 mM de bufferde fosfatos de potasio (pH 7.0), 0.25 mM 4-aminoantipirina51

Rev Mex Cienc Farm 48 (2) 2017y 2 mM de ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibencenosulfónico. Lalectura se realizó 15 minutos después a 520 nm.Análisis estadísticoLos datos obtenidos en la prueba del laberinto de Barnesfueron analizados con un ANOVA de medidas repetidas y unaprueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los resultadosobtenidos en la actividad enzimática de la SOD, la GPx y laCAT, se analizaron con un ANOVA de una vía y una pruebade comparaciones múltiples de Tukey.Resultados y discusiónLaberinto de BarnesExisten estudios con cafeína en los que se emplean dosisbajas20 o dosis altas,21,22 con la intención de contribuir alesclarecimiento de que dosis son más adecuadas para observarlos efectos buscados, en el presente trabajo se administraron7.5 y 15 mg/kg de dicha sustancia. En la figura 1, se muestraque la administración crónica de cafeína favorece elaprendizaje y la memoria espacial ya que disminuye el tiempode latencia para encontrar la caja de escape en comparacióncon las ratas control Aprendizaje y las administradas conSSI. Resultados similares han sido reportados por Abreuy cols.,12 en este trabajo los autores emplean la tarea dereconocimiento de objetos para evaluar la memoria espacialy administran una solución de cafeína al 0.08 % y de café al6 %, solo encuentran diferencia entre estos grupos y el grupocontrol y no, entre las diferentes concentraciones de cafeína,de igual manera a los reportados en esta investigación; losefectos encontrados con la dosis 7.5 mg/kg son iguales a losproducidos por 15 mg/kg. Esta mejora en la adquisición y enla recuperación de la información espacial puede deberse aque la cafeína bloquea los receptores A1 y A2A de adenosinaFigura 1. La administración crónica de cafeína en ratasSprague-Dawley. Las barras muestran el valor de lasmedias DE. ANOVA de medidas repetidas y prueba decomparaciones múltiples de Tukey (*p 0.05).52que se localizan en las neuronas del hipocampo,13,15,23 elbloqueo de los receptores A1, los cuales son más abundantesen el hipocampo,24 favorecen el establecimiento de lapotenciación a largo plazo (LTP) lo que explicaría la mejoraen la ejecución de la tarea.Laurent y colaboradores25 mostraron que ratonestransgénicos que no expresan receptores A2A tienen mejorejecución en el laberinto en “Y” y en el laberinto acuático deMorris tareas que dependen del hipocampo. Además, se sabeque la cafeína estimula la expresión del factor neurotróficoderivado del cerebro (BDNF), una neurotrofina involucradaen los procesos mnemónicos de tipo espacial,20,26,27 la cualactiva factores de transcripción en el núcleo neuronal quepromueven la LTP permitiendo el aprendizaje espacial.13,14Por otro lado, la producción y acumulación de especiesreactivas de oxigeno (ROS) son un denominador comúnen muchas enfermedades neurodegenerativas como laenfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinsony la enfermedad de Huntington provocando deterioro enel aprendizaje y la memoria.28,29 En este experimento, lacafeína administrada crónicamente aumento la actividadde las enzimas antioxidante SOD y GPx pero no de laCAT en el hipocampo, sugiriendo que las neuronas de estaregión cerebral están involucradas en la disminución de laproducción de las ROS.30 Esta idea es posible considerandoque en las neuronas del hipocampo aumenta la expresióndel BDNF y la actividad de las enzimas SOD y GPx con laadministración de cafeína.31Figura 2. La administración crónica de cafeínaaumenta la actividad de la superóxido dismutasa.Las barras muestran el valor de la media DE (n 6). ANOVA de una vía y prueba decomparaciones múltiples de Tukey (*p 0.05).

REVISTAMEXICANADE CIENCIASEl mecanismo de acción de la cafeína en las neuronas dauna posible explicación a los resultados obtenidos en estetrabajo; el bloqueo de los receptores A1 adenosinérgicosinhibe la acción de las fosfodiesterasas, activa los canalesde Ca permitiendo la liberación de neurotransmisoresy la posterior fosforilación de CREB, NRF2, y FOXO3que modulan la transcripción de genes que codifican laexpresión de enzimas antioxidantes como SOD y GPX.32,33Sin embargo, no hay cambio en la actividad de la catalasa,una posible explicación sería que el incremento de la GPXfue suficiente para reducir al H2O2 generado por la acción dela SOD.9 Por otro lado, existen evidencias sobre los efectosdiferenciados que la cafeína produce en ratas hembras ymachos.34 En el presente trabajo solo se emplearon hembraspara no introducir la variable hormonal35 a los experimentosconductuales.FARMACÉUTICASFigura 4. La administración crónica de cafeína nomodifica la actividad de la catalasa. Las barras muestranel valor de las medias DE (n 6). ANOVA de una vía yprueba de comparaciones múltiples de Tukey (* p 0.05).AgradecimientosEste trabajo fue apoyado por la VIEP, MAGM-NAT17-1 yPROFOCIE, 2017. CA 154.Al personal del Bioterio Claude Bernard. BUAP.ReferenciasFigura 3. La administración crónica de cafeínaaumenta la actividad de la glutatión peroxidasa.Las barras muestran el valor de las medias DE (n 6). ANOVA de una vía y prueba decomparaciones múltiples de Tukey (*p 0.05).ConclusiónLos resultados obtenidos permiten concluir que la cafeínafacilita el aprendizaje y la memoria espacial, cuando estosprocesos son evaluados en el laberinto de Barnes, asímismo, esta sustancia posee actividad antioxidante debido aque aumenta la actividad de las enzimas SOD y GPx en elhipocampo de rata.1. Sharma S, Rakoczy S, Brown-Borg H. Assessment ofspatial memory in mice. Life Sci. 2010;87:521-536.2. Manns RJ, Eichenbaum H. A cognitive map for objectmemory in the hippocampus. Learn Mem. 2009;16:616624.3. Barnes CA. Memory deficits associated with senescence:a neurophysiological and behavioral study in the rat. JComp Physiol Psychol. 1979;93(1):74-104.4. Dawood MY, Lumley LA, Robison CL, Saviolakis GA,Meyerhoff JL. Accelerated Barnes maze test in mice forassessment of stress effects on memory. Ann New YorkAcad Sci. 2004;1032:304-307.5. Dias V, Junn E, Mouradian MM. The Role of OxidativeStress in Parkinson’s Disease. J Parkinsons Dis.2013;3:461–491.6. Patten DA, Germain M, Kelly MA, Slack RS. Reactiveoxygen species: stuck in the middle of neurodegeneration.J Alzheimers Dis. 2010;20(2):357-367.7. Steckert AV, Valvassori SS, Moretti M, Dal-Pizzol F,Quevedo J. Role of oxidative stress in the pathophysiology53

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la administración crónica de la cafeína sobre la memoria espacial y la actividad de las enzimas antioxidantes en el hipocampo de rata. Materiales y métodos Los sujetos de experimentación fueron ratas hembra de la cepa Sprague-Dawley con un peso de 200-260 g, provenientes del bioterio Claude Bernard de la Benemérita