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CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOMÉTODO 2Tejidos vegetalesMétodo 2.3Rev.2004CALCINACIÓN2.3 En presencia de óxido de plata y bicarbonato de sodio1Principio1.1 La muestra de tejido vegetal seca y molida se mezcla con óxido de plata ybicarbonato de sodio y se calcina a 550ºC. Las cenizas se disuelven en ácidoacético diluido y en la solución resultante se puede determinar la concentración deS-SO4.2Equipos y materiales especiales2.1 Crisoles o cápsulas de porcelana o sílice de 30 mL de capacidad con tapa o vidriode reloj.2.2 Mufla.2.3 Plancha calefactora.3Reactivos3.1 Agua con una conductividad específica no mayor de 0,2 mS/m a 25 C.Nota 1Usar agua de esta calidad en Reactivos (3) y Procedimiento (4).3.2 Mezcla alcalina.Mezclar 2 g de óxido de plata, Ag2O, con 50 g de bicarbonato de sodio, NaHCO3.3.3 Ácido acético, C2H4O2.3.3.1 C2H4O2 100% d 1,05 kg/L3.3.2 C2H4O2 96% d 1,06 kg/L3.5 Solución de ácido acético 1 mol/L.Diluir 57 mL de C2H4O2 100% (3.4.1) o 59 mL de C2H4O2 96% (3.4.2) a 1000 mLcon agua.4Procedimiento4.1 Pesar 0,100 0,005 g de muestra seca y molida a 0,5 mm de tejido vegetal en uncrisol (2.1). Incluir dos blancos y una muestra de referencia.4.2 Agregar 0,52 g de mezcla alcalina (3.3) y mezclar. Golpear suavemente el crisolcontra el mesón para emparejar la superficie de la mezcla.4.3 Agregar 0,5 g de NaHCO3 sobre la superficie de manera de cubrir completamentela muestra.4.4 Colocar los crisoles en la mufla y calentar a 550ºC durante 3 horas. Enfriar.4.5 Agregar cuidadosamente 15 mL de la solución de ácido acético 1 mol/L (3.5).Página 11 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOTejidos vegetalesMétodo 2.3Rev.20044.6 Calentar en una plancha calefactora a 200ºC durante 20 min. Enfriar.4.7 Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 50 mL y enrasar con agua.4.8 Determinar la concentración de S-SO4 por el Método 11.2 de Tejidos vegetales.5Referencias5.1 KALRA, Y.P. (Ed.) 1998. Handbook of reference methods for plant analysis. Soiland Plant Analysis Council, Inc. CRC Press, USA: 300p.Página 12 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOMÉTODO 3Tejidos vegetalesMétodo 3.1Rev.2004DIGESTIÓN3.1 En tubo con H2SO4-ácido salicílico-catalizador.1Principio1.1 La muestra de tejido vegetal seca y molida se digiere en tubo con H2SO4-ácidosalicílico-catalizador. Este método está diseñado especialmente para la determinación de N pero también pueden determinarse Ca, Mg, Mn, Na, P y Zn.2Equipos y materiales especiales2.1 Digestor de tubos capaz de alcanzar una temperatura de 380ºC.2.2 Tubos de digestión de 50-100 mL de capacidad.2.3 Agitador vortex.3Reactivos3.1 Agua con una conductividad específica no mayor de 0,2 mS/m a 25 C.Nota 1Usar agua de esta calidad en Reactivos (3) y Procedimiento (4).3.2 Acido sulfúrico, H2SO4 98 %, densidad 1,84 kg/L.3.3 Mezcla catalítica.3.3.1 Disponible en el comercio3.3.2 Mezclar moliendo en un mortero 100 g de sulfato de potasio, K2SO4, 10 gde sulfato de cobre, CuSO4, 10 g de ácido salicílico, C7H6O3, y 1 g deselenio, Se, en polvo.3.4 Agua oxigenada, 25-30% de H2O2 (no esencial)4Procedimiento4.1 Pesar 0,1 a 0,5 g (exactitud 0,001g) de muestra seca y molida a 0,5 mm de tejidovegetal en un tubo de digestión (2.2). Incluir dos blancos y una muestra de referencia.Nota 2Es conveniente secar nuevamente la muestra a 70ºC antes de pesar porque, si contiene más deun 5% de agua, puede perderse nitrato debido al calentamiento que se produce con la adición posterior de ácido sulfúrico.4.2 Agregar 2 g de mezcla catalítica (3.3).4.3 Agregar 5,0 mL de H2SO4 (3.2).4.4 Mezclar sobre un agitador vortex (2.3) durante 15 segundos.Nota 3Es esencial que la muestra se humedezca completamente.Página 13 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOTejidos vegetalesMétodo 3.1Rev.20044.5 Dejar reposar al menos 2 h.Nota 4El reposo es necesario para que se formen los compuestos nitro-salicílicos.4.6 Colocar los tubos en el digestor y calentar a 100ºC por al menos 2 h.Nota 5Este tratamiento es necesario para la reducción completa de los compuestos nitro-salicílicos.4.7 Subir la temperatura del digestor a 380ºC y mantenerla por 2 horas.Nota 6Si se forma una cantidad excesiva de espuma, sacar los tubos del digestor, enfriar por 2 min yagregar lentamente porciones de 1 mL de H2O2 (3.4) hasta la desaparición de la espuma ycontinuar con la digestión a 380ºC. Al final puede persistir un color verde azulado.4.8 Sacar los tubos del digestor y dejar enfriar bajo campana por 5-10 min.4.9 Agregar 10-20 mL de agua para prevenir la formación de cristales.4.10 Filtrar a través de un papel filtro de tamaño de poro 11 µm y recibir en un matrazaforado de 50 mL, lavar y enrasar con agua.Nota 7.Si se determinará solamente N por destilación (Método 5.1), se puede omitir este punto.4.11 En el filtrado se puede determinar la concentración de N por destilación y titulaciónmanual (Método 5.1) o por colorimetría (Método 5.2).5Referencias5.1 KALRA, Y.P. (Ed.) 1998. Handbook of reference methods for plant analysis. Soiland Plant Analysis Council, Inc. CRC Press, USA: 300p.5.2 WALINGA, I., VAN DER LEE, J.J., HOUBA, V.J.G., VAN VARK, W. and NOVOZAMSKY, I. 1995. Plant analysis manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,The Netherlands, 253p.Página 14 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOMÉTODO 3Tejidos vegetalesMétodo 3.2Rev.2004DIGESTIÓN3.2 En matraz con H2SO4-ácido salicílico-H2O2.1Principio1.1 La muestra de tejido vegetal seca y molida se digiere en un matraz con H2SO4ácido salicílico-H2O2. Este método está diseñado especialmente para la determinación de N pero también pueden determinarse Ca, K, Mg, Mn, Na, P y Zn.2Equipos y materiales especiales2.1 Plancha calefactora capaz de alcanzar una temperatura de 300ºC.3Reactivos3.1 Agua con una conductividad específica no mayor de 0,2 mS/m a 25 C.Nota 1Usar agua de esta calidad en Reactivos (3) y Procedimiento (4).3.2 Mezcla para digerir.A un matraz erlenmeyer de 250 mL, colocado en un baño de agua fría, agregar: 18 mL de agua, 100 mL de ácido sulfúrico 96%, d 1,84 kg/L, en pequeñas porciones yagitando, 6 g de ácido salicílico, C7H6O3. Disolver con la ayuda de un agitadormagnético.3.3 Agua oxigenada, 25-30% de H2O2.4Procedimiento4.1 Pesar 0,1 a 0,5 g (exactitud 0,001g) de muestra seca y molida a 0,5 mm de tejidovegetal en un papel de aluminio y transferir a un matraz aforado de 50 mL o matraz erlenmeyer de 100-125 mL Incluir dos blancos y una muestra de referencia.4.2 Agregar 5 mL de la mezcla para digerir (3.2) y agitar cuidadosamente hasta quetoda la muestra se humedezca.4.3 Dejar reposar durante la noche.Nota 2El reposo es necesario para que se formen los compuestos nitro-salicílicos.4.4 Calentar en la plancha calefactora (2.1) a 180ºC durante 1 hora.Nota 3Este tratamiento es necesario para la reducción completa de los compuestos nitro-salicílicos.4.5 Sacar los matraces de la plancha y dejar enfriar.Página 15 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOTejidos vegetalesMétodo 3.2Rev.20044.6 Agregar 5 gotas de agua oxigenada (3.3).4.7 Colocar en la plancha y subir la temperatura a 280ºC y calentar por 5-10 min hastala aparición de humos blancos.4.8 Repetir los puntos 4.5 a 4.7 hasta que el digerido se torne incoloro.4.9 Sacar los matraces de la plancha y dejar enfriar.4.10 Agregar alrededor de 10-20 mL de agua y agitar hasta disolución del precipitado.4.11 Filtrar a través de un papel filtro de tamaño de poro 11 µm y recibir en un matrazaforado de 50 mL, lavar y enrasar con agua.Nota 4Si se determinará solamente N por destilación (Método 5.1), se puede omitir este punto.4.11 En el filtrado se puede determinar la concentración de N por destilación y titulaciónmanual (Método 5.1) o por colorimetría (Método 5.2).5Referencias5.1 WALINGA, I., VAN DER LEE, J.J., HOUBA, V.J.G., VAN VARK, W. and NOVOZAMSKY, I. 1995. Plant analysis manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,The Netherlands, 253p.Página 16 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOMÉTODO 4Tejidos vegetalesMétodo 4.1Rev.2004EXTRACCIÓN4.1 Con agua1Principio1.1 La muestra de tejido vegetal seca y molida se extrae con agua y en el filtrado sepueden determinar las concentraciones de Cl, N-NO3, N-NO2 y S-SO4.Nota 1Este es un método de extracción semicuantitativo porque extrae solamente los aniones que están“libres” en el tejido vegetal2Equipos y materiales especiales2.1 Agitador recíproco.2.2 Papel filtro de tamaño de poro 3 µm.3Reactivos3.1 Agua con una conductividad específica no mayor de 0,2 mS/m a 25 C.4Procedimiento4.1 Pesar 1 g (exactitud 0,001g) de muestra seca y molida a 1 mm de tejido vegetal enun papel de aluminio y transferir a un matraz erlenmeyer de 100 mL Incluir dosblancos y una muestra de referencia.4.2 Agregar 50 mL de agua (3.1).4.3 Agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente.4.4 Filtrar por papel filtro plegado (2.2).4.5 Si el filtrado sale turbio, volver a pasarlo por el mismo papel filtro.4.6 En el filtrado se pueden determinar las concentraciones de Cl (Método 13.1), NNO3 (Método 14.1), N-NO2 y S-SO4.5Referencias5.1 WALINGA, I., VAN DER LEE, J.J., HOUBA, V.J.G., VAN VARK, W. and NOVOZAMSKY, I. 1995. Plant analysis manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,The Netherlands, 253p.Página 17 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOMÉTODO 4Tejidos vegetalesMétodo 4.2Rev.2004EXTRACCIÓN4.2 Con ácido acético 2%1Principio1.1 La muestra de tejido vegetal seca y molida se extrae con ácido acético 2% y en elfiltrado se pueden determinar las concentraciones de Cl, N-NH4, N-NO3, P-PO4 yS-SO4.Nota 1Este es un método de extracción semicuantitativo porque extrae solamente los aniones que están“libres” en el tejido vegetal2Equipos y materiales especiales2.1 Agitador recíproco.2.2 Papel filtro de tamaño de poro 3 µm.3Reactivos3.1 Agua destilada con una conductividad específica no mayor de 0,2 mS/m a 25 C.3.2 Ácido acético 2%Diluir 20 mL de CH3COOH 100% con agua (3.1) a 1 L.4Procedimiento4.1 Pesar 0,2 a 0,5 g (exactitud 0,001g) de muestra seca y molida a 0,5 mm de tejidovegetal en un papel de aluminio y transferir a un matraz erlenmeyer de 100 mL Incluir dos blancos y una muestra de referencia.4.2 Agregar 50 mL de ácido acético 2% (3.2).4.3 Agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente.4.4 Filtrar por papel filtro plegado (2.2).4.5 Si el filtrado sale turbio, volver a pasarlo por el mismo papel filtro.4.6 En el filtrado se pueden determinar las concentraciones de Cl (Método 13.1), NNH4, N-NO3, P-PO4 y S-SO4.5Referencias5.1 KALRA, Y.P. (Ed.) 1998. Handbook of reference methods for plant analysis. Soiland Plant Analysis Council, Inc. CRC Press, USA: 300p.Página 18 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOMÉTODO 5Tejidos vegetalesMétodo 5.1Rev.2004NITRÓGENO5.1 Digestión y determinación por destilación y titulación manual1Principio1.1 En el filtrado proveniente de la digestión según el Método 3.1 o el Método 3.2, sedetermina la concentración de N-NH4 por destilación de NH3 y titulación manual.2Equipos y materiales especiales2.1 Destilador por arrastre de vapor.2.2 Titulador automático (no indispensable).3Reactivos3.1 Solución de hidróxido de sodio, NaOH, 400 g/L.Disolver 2 kg de NaOH en pellets en aprox. 3 L de agua. Enfriar la solución con elfrasco tapado para evitar la absorción de CO2. Diluir a 5 L con agua recién herviday enfriada. Mezclar bien y guardar protegido del CO2 ambiental.3.2 Indicador mezclado.Disolver 0,165 g de rojo de metilo y 0,30 g de verde de bromocresol en 500 mL deetanol 96 %.3.3 Solución de ácido bórico-indicador.Disolver 20 g de ácido bórico, H3BO3, en aprox. 900 mL de agua caliente, enfriar yagregar 20 mL de indicador (3.2). Diluir a 1 L con agua y mezclar bien.3.4 Solución estándar de nitrógeno, 0,01 mol/L de N-NH4.Disolver 0,6607 g de sulfato de amonio, (NH4)2SO4, seco a 105ºC, en alrededor de400 mL de agua. Agregar 45 mL de H2SO4 96%, d 1,84 kg/L, enfriar y diluir conagua a 1000 mL.3.5 Acido clorhídrico estándar 0,010 mol/L.Disponible en el comercio.4Procedimiento4.1 Encender el destilador por arrastre de vapor hasta ebullición.4.2 Transferir con una pipeta 10 mL de solución de ácido bórico-indicador (3.3) a unmatraz erlenmeyer de 100-125 mL y colocarlo bajo el extremo del condensador.4.3 Transferir cuantitativamente el contenido del tubo de digestión proveniente delpunto 4.9 del Método 3.1 o del matraz proveniente del punto 4.10 del Método 3.2(o una alícuota que contenga 0,1 a 3,0 mg de N-NH4 del filtrado del punto 4.10 oPágina 19 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOTejidos vegetalesMétodo 5.1Rev.20044.11, respectivamente) al matraz del destilador, diluir a aprox. 50 mL con agua yconectar al sistema.4.4 Agregar 30 mL de solución de NaOH 400 g/L (3.1) al matraz de destilación, lavarcon una pequeña cantidad de agua y cerrar la llave.4.5 Destilar aproximadamente 75 mL o durante el tiempo óptimo para el sistema enuso.4.6 Sacar el matraz del destilador, lavar el extremo del condensador y titular eldestilado con HCl 0,01 mol/L (3.5) hasta que el color cambie de verde a rosado.Nota 1Puede usarse un titulador automático (2.2) fijando el punto final a pH 4,6 y omitiendo la adición deindicador mezclado.4.7 Verificar el procedimiento destilando alícuotas de la solución estándar de N-NH4(3.4).5Cálculos5.1 Calcular la concentración de N en la muestra, en % o en g/kg, según:N (%) (a - b) M V 1,4m AN (g/kg) 6donde:abMV m A (a - b) M V 14m Avolumen en mL de HCl gastado en la muestravolumen promedio en mL de HCl gastado en los blancosconcentración en mol/L del HClvolumen final en mL del filtrado. (Método 3.1, punto 4.10 oMétodo 3.2, punto 4.11) (si corresponde)masa en g de la muestra (Método 3.1, punto 4.1 o Método3.2, punto 4.1)alícuota en mL del filtrado (Método 3.1., punto 4.10 o Método3.2, punto 4.11) (si corresponde)Informes6.1 Informar la concentración de N en % con dos decimales o en g/kg con un decimal.7ReferenciasPágina 20 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOTejidos vegetalesMétodo 5.1Rev.20047.1 KALRA, Y.P. (Ed.) 1998. Handbook of reference methods for plant analysis. Soiland Plant Analysis Council, Inc. CRC Press, USA: 300p.7.2 WALINGA, I., VAN DER LEE, J.J., HOUBA, V.J.G., VAN VARK, W. and NOVOZAMSKY, I. 1995. Plant analysis manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,The Netherlands, 253p.Página 21 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELOMÉTODO 5Tejidos vegetalesMétodo 5.2Rev.2004NITRÓGENO5.2 Digestión y determinación colorimétrica1Principio1.1 En el filtrado proveniente de la digestión según el Método 3.1 o Método 3.2, sedetermina la concentración de N-NH4 por colorimetría.2Equipos y materiales especiales2.1 Espectrofotómetro visible con celdas de una longitud de paso de luz de 10 mm.2.2 Agitador vortex3Reactivos3.1 Agua destilada con una conductividad específica no mayor de 0,2 mS/m a 25 C yun pH mayor de 5,6.Nota 1Usar agua de esta calidad en Reactivos (3) y Procedimiento (4).3.2 Solución de hidróxido de sodio, NaOH, 50%.Disolver 100 g de NaOH en agua, enfriar y diluir 200 g.3.3 Disodio hidrógeno fosfato3.3.1 Na2HPO43.3.2 Na2HPO4.2H2O3.3.3 Na2HPO4.12H2O3.4 Solución tampón.En un matraz aforado de 1000 mL agregar: alrededor de 600 mL de agua, 14,2 g de Na2HPO4 (3.3.1) o 17,8 g de Na2HPO4.2H2O (3.3.2), o 35,8 g deNa2HPO4.12H2O (3.3.3) y disolver, 50 g de tartrato de potasio y sodio, C4H4KNaO6.4H2O, y disolver, 108 g de solución de NaOH 50% (3.2) y mezclar, agua hasta enrasar.3.5 Solución de salicilato-nitroprusiato.Disolver 150 g de salicilato de sodio, C7H5NaO3, y 0,30 g de nitroprusiato de sodio,Na2[Fe(CN)5NO].2H2O, en agua y diluir a 1 L. Almacenar en frasco oscuro.3.6 Solución de hipoclorito de sodio.Diluir 6 mL de solución de hipoclorito de sodio, NaClO, 5,25% a 100 mL con agua.Preparar diariamente.3.7 Ácido sulfúrico, H2SO4, 98% d 1,84 kg/L.3.8 Solución para diluirPágina 22 de 53

CNACOMISIÓN DE NORMALIZACIÓN Y ACREDITACIÓNSOCIEDAD CHILENA DE LA CIENCIA DEL SUELO3.8.1Tejidos vegetalesMétodo 5.2Rev.2004Disolver 1,6 g de la mezcla catalítica usada en la digestión (Método 3.1,reactivo 3.3) en 4 mL de H2SO4 98% (3.7) y diluir con agua con precaucióna 2 L.Nota 2Esta solución se usa cuando la muestra digerida proviene del Método 3.13.8.2Diluir 4 mL de la mezcla para digerir (Método 3.2, reactivo 3.2) con agua a2 L.Nota 3Esta solución se usa cuando la muestra digerida proviene del Método 3.2.3.9 Solución estándar de nitrógeno, 1000 mg/L de N-NH4.Disolver 4,715 g de sulfato de amonio, (NH4)2SO4, seco a 105ºC, en solución paradiluir (3.8.1 o 3.8.2) en un matraz aforado de 1000 mL. Enrasar con la soluciónpara diluir (3.8.1 o 3.8.2).3.10 Solución estándar de nitrógeno, 100 mg/L de N-NH4.Diluir 10 mL de la solución estándar de 1000 mg/L de N-NH4 (3.9) a 100 mL consolución para diluir (3.8.1 o 3.8.2).3.11 Serie de estándares de N-NH4.Diluir 0-1-2-3-4-5 mL de la solución estándar de 100 mg/L de N-NH4 (3.10) a 100mL con la solución para diluir (3.8.1 o 3.8.2).Esta serie de estándares contiene 0-1-2-3-4-5 mg/L de N-NH4.4Procedimiento4.1 Diluir 50 veces el digerido que ya está diluido a 50 mL (Método 3.1, punto 4.10 oMétodo 3.2, punto 4.11) tomando 1 mL en un matraz aforado de 50 mL y enrasando con agua.4.2 Transferir 1 mL de esta dilución y de la serie de estándares de N-NH4 (3.11) a untubo de ensayo.4.3 Agregar 5,5 mL de la solución tampón (3.4) y mezclar sobre el agitador vortex(2.2).4.4 Agregar 4 mL de solución de salicitalo-nitroprusiato (3.5) y mezclar.4.5 Agregar 2 mL de solución de hipoclorito de sodio (3.6) y mezclar.4.6 Dejar reposar durante 45 min. a 25ºC o 15 min. A 37ºC.4.7 Leer la absorbancia a 650 nm antes de 2 horas.Nota 4Agitar cada tubo sobre el agitador vortex inmediatamente antes de leer.5Cálculos5.1. Dibujar una curva de calibración con las absorbancias y las concentraciones de NNH4 de la serie de estándares (3.11) y calcular la ecuación de regre

tamiz de 1,0 mm si para el análisis se requiere una alícuota 0,5 g o de un tamiz de 0,5 mm si se requiere una alícuota 0,5 g. 4.8 Después de la molienda, homogenizar la muestra y separar una porción de 5 a 10 g para los análisis y almacenaje. Almacenaje 4.9 Colocar la porción de muestra representativa, molida y homogénea, en un