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BD FACSCalibur flow cytometerFACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)
Un citometro a flusso è essenzialmente costituito di: Sistema fluidico per il trasporto del campione e lasua focalizzazione idrodinamica Sistema ottico Circuito di rilevazione Elettronica per l’acquisizione, elaborazione epresentazione dei dati.
The fluidic systemAir filterAir pumpFlowchamberSheat reregulatorSample
Hydrodynamic focusingLow pressureHigh pressureHigh sampleflow rate60µl/minLow sampleflow rate12µl/minLaminarFlowLaminarFlowSample coreSheathSampleSheathSheathSampleSheath
LIGHT SCATTERRifrazione e Riflessioneproporzionale alla granularità cellularee alla complessità.Rilevate a 90 rispetto la luce Proporzionale all’areadella cellula.Rilevata lungo l’assedella luce incidente 0 .
Discrimination of different cell populations inblood based on light scatteringgranulocyteshumanSideScatterLysed whole bloodForward Scatterlymphocytesmonocytes
Characterization of unstained cells usinglight scatter
The fluorescence phenomenonE’ il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosadi definita lunghezza d’onda (λ) ne emette un’altra a λ maggiore e adenergia inferiore.
FLUOROCROMIMolecolefluorescenti che assorbono energia dal laser erilasciano l’energia assorbita per:- Vibrazione e dissipazione del calore- Emissione di fotoni di una lunghezza d’onda più lunga.Sono coniugate a ligandi o anticorpi monoclonali specifici permolecole biologiche con significato antigenico o recettorialeposizionate sulla membrana cellulare, nel nucleo o nel citosol;altri “colorano” direttamente altre sostanze (DNA, RNA,proteine, ioni citoplasmatici).Anche le cellule non marcate con alcun fluorocromo presentanouna debole fluorescenza di fondo, l’autofluorescenza,misurabile.
Absorption and emission spectra of a fluorochrome(Stokes shift)Ogni fluorocromo presenta una caratteristica banda di λper l’eccitazione e per l’emissione
Ifluorocromiattualmentecitofluorimetria sono: FITCPEFluorocromi tandemAPCPI (Propidium Iodide)PerCPpiùCiascun fluorocromo è caratterizzatoparticolare BRILLANTEZZA.usatiindauna
Absorption andfluorochromesemissionspectraAbsorption spectra1000PerCPFITCPIRPE550600ofdifferentEmission spectraAPCFITCRPEPI APC PerCP8006004002000400450500650700400450Wavelenght (nm)500550600650700
Tandem 670APC-Cy7(PharRed)650767Composti fluorescenti costruiti unendo fra loro molecole con proprietàfotofisiche complementari, atte a sfruttare il principio di trasferimentodell’energia.
Correlation between number of binding sites andfluorescence intensityFITCFITCFITCNumber of eventsFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFluorescence intensityEmitted fluorescence intensity binding sites
Stainingofcellswithfluorochromeantibobies specific for surface antigensanti-A AntibodyAntigen Afluorochromesanti-B AntibodyAntigen Bconjugated
Single and three colours ingacquisition
Indirect stainingSecond antibodyGoat Anti-Mouse Ig FITCFirst unconjugatedmouse antibodyAcquisition andAnalysisIncubationIncubationwashingwashing
Optic system of a flow cytometerFITCSSCPE / PIPerCP7-AADPE-Cy5FSC
Optical filtersLongpass460500LP 500Shortpass540460500SP 500540Bandpass460500BP500/50540
Optic system of a BD FACSCalibur flow cytometer,equipped with two lasersFL1530/30I segnali di fluorescenzaemessi dalla cellula vengonoraccolti da lenti posteortogonalmente al fascio dieccitazione, selezionati conopportuni specchi separatori difascio, specchi dicroici e filtriottici e portati ciascuno ad undiverso PMT.SSC488/10FL2 585/42FL490/10 Beam Splitter661/16DM 560SPDM 640LP670LPHalf MirrorFluorescenceCollection LensFL3Beam Combiner.FlowCell488/10FocusingLensFSC Diode
FLUORESCENCE MEASUREMENTS
Generation of an electrical pulseVoltageSensori denominati PMT o detectors trasformano i segnali ottici inintensità di corrente elettrica, oltre ad amplificare lo stesso segnale inmaniera lineare o logaritmica.VoltageTimeVoltageTimeTime
Conversion of electrical pulses in digital valuesSSC FSCPulse heightI segnali provenienti dai PMT sono impulsi analogici, ossia proporzionali inmaniera continua alle dimensioni del parametro misurato.Un convertitore “spezzetta” i valori continui rendendoli discreti aseconda del numero di canali a disposizione.0pulsewidthFL3 FL2 FL1VoltsPulsearea40Time (µSec)ChannelsAnalog todigitalconverter01000
Histogram plotNumero di CellsIl diagramma ad istogrammi rappresenta graficamente la misura di unsingolo parametro. Gli eventi che si accumulano nei vari canali vanno acostruire un diagramma di distribuzione.05001000490500510Incremento di intensità
Histogram analysisLa statistica si basa sulla impostazione di cursori che definiscono le areedi interesse calcolando gli eventi che cadono al loro interno.Unstained sampleStained L-1101FL-1Antibody cellsAntibody cells
HISTOGRAM
Dot plotIl diagramma di dispersione a punti o dot plot rappresenta lacorrelazione fra due parametri, in cui ogni punto rappresenta un singoloevento dotato di un particolare valore per ciascuno dei due parametri.10001000840600FL2FL28004002008500200 400 600 800 1000FL180060040020000200 400 600 800 1000245FL1638
Dot plot analysisquadrantsUpper LeftSingle positiveCD4 PEUpper Right Double positiveULLLURLRCD3 FITCLow LeftDouble negativeLow RightSingle positiveULCD3-/CD4 URCD3 /CD4 LLCD3-/CD4-LRCD3 /CD4-
DOT PLOT
Isolation of PBMC by ficoll gradient centrifugationstratificationPlasma plateletscentrifugebloodPBMCFicollerytrocytes granulocytesFicollPeripheral Blood Mononuclear Cells PBMC
SSCCD4 APCImmunophenotyping technique for determining % of CD4and CD8 T cellsCD45 PerCpCD8 PECD3 FITCCD3 FITC
SPT-specimen processing50 µL whole blood (EDTA)20 µL Antibody mixTubewithbeadsVortex15 Minutes @ Room Temperature, dark450 µL FACS Lysing buffer (1x)Vortex15 Minutes @ Room Temperature, darkAcquisition and Analysis
SPT-sample eCD4 PESide ScatterGranulocytesLymphocytesCD45 PerCPCD3 FITCTotal no. ofNo. of events in the brightX microfluorospheres addedCD45 region Absolute no. of CD4Volume of blood addedNo. of events in themicrofluorosphere region
�Enzymatic reaction
ELISpotChromogenSubstrateinsoluble couloredproductEnzyme conjugated tothe detection antibodyCYTOKINEDetectionanti-cytokine antibodyCaptureanti-cytokineantibody
ELISpot
Simultaneous phenotypic (naive/memory phenotype) andfunctional (IFN-γ production) characterization of antigenstimulated CD8 T lymphocytesIFNγ-positive cells 7 NaiveCD45RA CCR7 Pre-EffectorCD45RA-CCR7-Effector CTLCD45RA CCR7-CD45RAIFNγ-negative cells (R2)
Simultaneous phenotypic and functional (IFN-γ productionand cytotoxic potential) characterization of antigenstimulated T lymphocytesLymphocytes (R1)CD3 CD8 Lymphocytes (R1 and R2)1,11%0,05%Side ScatterCD8 PerCPIFN-gamma PE69,27% 29,56 %Forward ScatterCD3 APCPerforin FITC
Class I MHC Tetramer
Analysis of proliferation by CFSE labelling
Analysis of the proliferation of PHA stimulatedCD8 T lymphocytes by CFSE labellingNo CFSECFSE Not stimulatedCFSE PHA 0,5 µg/mlCFSE PHA 1 µg/ml
Analysis of the proliferation of PHA stimulatedCD4 T lymphocytesStimulated with PHACD4Not stimulatedCFSE (Fluorescence intensity FL1)Proliferation (cell division)
Analisi del ciclo cellulareAB
Analisi del ciclo cellulare
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio)
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio Annessina V)
Analisi dell’apoptosi (Ioduro di Propidio Annessina V)
http://www.bdbiosciences.com/support/training/itf launch.jsp
Flow Cell Flow Cell Optic system of a BD FACSCalibur flow cytometer, equipped with two lasers I segnali di fluorescenza emessi dalla cellula vengono raccolti da lenti poste ortogonalmente al fascio di eccitazione, selezionati con opportuni specchi separatori di fascio, specchi dicroici e filtri ottici e portati ciascuno ad un diverso PMT.
