Transcription
��ト部仲 健太 2014 Illumina, Inc. All rights reserved.Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate,HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iScan, iSelect, ForenSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeqFGx, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina, SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq,TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks of Illumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the U.S. and/orother countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.
第２部 NGSを利用した実験の組み立て方2
学感染症製薬
��トーム解析HiSeq25001000 Gb / ラン6日 / P-Seq解析NextSeq 500120 Gb / ラン1日 / ランSmall ��リQC4MiSeq 15 Gb / ラン 3日 (55時間) / ラン
�なにを読むのか– � メタゲノムどう読むのか– リシーケンス– アセンブルどこを読みたいのか– 全ゲノム– 遺伝子領域目的は何か––––SNP & ��検出どういう精度を得たいのか– ざっくりと傾向をつかむ– �ザインリード長の選択– 35bp, 50bp, 75bp, 100bp .（任意）ライブラリーの選択– シングルリード（片側読み）– ペアエンド（両端読み： 200-500bpインサート）– メイトペア（両端読み： 2-5kbインサート）データの厚み– 10x、20x、30x .実験をする上での制約コスト– プロジェクトの予算（試薬）時間– �ェクト数サンプル– 数、量、クオリティ など検証– その他の手法は？5
Aシーケンス解析1. 疾患パネル紹介2. メタゲノム解析2.6RNAシーケンス解析
�調製キットDNA用RNA用TruSeq DNAPCR-FreeTruSeq CustomAmplicon Low InputTruSeq AmpliconCaner PanelTruSeq StrandedmRNATruSeq SyntheticLong-ReadTruSeq ExomeTruSeq Rapid ExomeTruSeq StrandedTotal RNANextera DNANextera Rapid CaptureCustom EnrichmentTruSeq Small RNANextera XTTruSight Tumor 15TruSeq RNAAccessNextera Mate PairTruSight MyeloidTruSight RNAPan-CancerTruSeq TargetedRNA PanelTruSeq Nano DNATruSight疾患パネルTruSeq ChIP7TruSeq RNA
Total )サードパーティ
BaseSpace �タの共有クリックによる解析が可能
�(250 ンプル微生物Kraken (16S)SPAdes(de novo)100K300 PE500Gb 300 PE4.555サンプル3M 150SE0.25100サンプルIsaac Enrichment8Gb 75SE641サンプルBWA Enrichment8Gb 75SE927サンプルRNA Express10M 75SE0.125TopHat Cufflinks30M 75SE641サンプルTopHat Cufflinks50M 75PE1319サンプルIsaac WGS120Gb 150PE279サンプルBWA Whole Genome120Gb �スAmplicon 00サンプル全ゲノム解析10
��リプトームバクテリア de novo アセンブルその他Methyl-Seq
1. �ゲノム解析12
リコン生成TruSeqNextera, TruSightTruSeq Amplicon超音波による断片化 �ソームによる断片 ��による伸長とライゲーション ��ーゲットアンプリコン
�化 アダプターライゲーションRNA(Except for TruSeq PCR-free)データシート：TruSeq DNA PCR-Free サンプル調製キット（Pub. No. 770-2013-J001 20MAR2013）14 ing/apac/japan/documents/pdf/datasheet truseq dna pcr-free sample prep-j.pdf
ーム断片化 ra DNAサンプル調製キット（Pub. No. 770-2011-J021 ina-marketing/apac/japan/documents/pdf/datasheet nextera dna sample prep-j.pdf
��ライブラリーをプール3 ��ハイブリダイゼーションPCR, クラスター形成 &シーケンスデータシート：Nextera Rapid キャプチャーエクソーム（Pub. No. 770-2013-J002 ）16 ing/apac/japan/documents/pdf/datasheet nextera rapid capture exome-j.pdf
�子をターゲット
TruSight Cancer – 94 ��284 SNPsが解析できる臨床応用– �コストが高くかかってしまう）– �要性を決定– �究– ��情報引き出し）– �ワークフローに時間がかかる 18Somatic （体細胞変異）ではなく、Germline ��はない） 例） 癌患者の血液サンプル 例） 健康者の血液サンプル
TruSight Cancer ��ポーシス大腸がん；HNPCC）MSH2, �イド腫瘍APCBRCA1, BRCA2 ata/genetic-familial.htmlTruSight Cancer ます。19
TruSight ght 与する174 ��ンテンツはImperial College of Londonとの共同研究20
に同じ変異があるかをテストYES: �セス– �セットで解析利点– 迅速な治療選択肢を提供 1週間– �遺伝性の有無）21NO: とくになし
�をカバーAortic Valve Disease3Marfan Syndrome3Loeys-Dietz Syndrome4Short QT Syndrome4CPVT# of genes6Familial Hypercholesterolemia7Restrictive Cardiomyopathy9Non-compaction Cardiomyopathy10Noonan Syndrome11AVRC11Brugada Syndrome13Structural heart disease15Long QT Syndrome15Familial Aortic Anuerysm16Familial atrial fibrillation21Hypertrophic Cardiomyopathy47Dilated Cardiomyopathy5902210203040506070
TruSight ght ��にフォーカスStephen Kingsmore博士、Carol Saunders博士、Hilger Ropers博士らによる設計– �療センター– マックスプランク研究所23
TruSight Inherited Diseases – 552 �� 新しいプロセス– 網羅的な遺伝子セットで解析利点– スピード（数ヶ月 1週間）– コスト効率– 網羅性Dr. Stephen Kingsmore： て利用24
TruSight isease4813 遺伝子をカバーTruSight 患関連遺伝子解析用のパネル25
TruSight �遺伝子のエクソーム解析TruSight Exome希少疾患パネル(2,761 genes)HGMD OMIM(1,966 genes)GeneTests.org(69 genes)Other TruSight(17 genes)26
�ットとしたTruSight Oneの実績27
日本におけるTruSight featured researchers.html28
��説常染色体劣性遺伝De Novo �検証実験別家系1 2組別家系の発症者2 3名
アンプリコン疾患パネルTruSeq AmpliconCancer TruSight Tumor ルTruSight Tumor トTruSight �子をターゲットComing soonTruSight 検出Coming soonTruSight 遺伝子をターゲットComing soonTruSight 0
��イゲーション q Custom Amplicon Low Inputライブラリー調製キット（Pub. No. 770-2015-J012 11DEC2015）31 ing/apac/japan/documents/pdf/datasheet tru seq custom amplicon low input.pdf
�断薬剤応答転移/再発
ICGC: International Cancer Genome ��現在12,807人ドナーが登録33
TCGA : The cancer genome atlas pan-canceranalysis 臨床データWeinstein, John N., et al. "The cancer genome atlas pan-cancer analysis project." Nature genetics 45.10 (2013): 1113-1120.34
��TruSight Cancer 94 �均カバレッジ 500xTruSight 腫瘍パネルTruSeq Amplicon Cancer 48 遺伝子 �ープット 15もしくは26 ��ジTruSight RNA Pan Cancer 351385 遺伝子 も1ランあたり8サンプルの解析が可能
イルミナがんパネルの比較TruSight 5%以下5%5%NA15 遺伝子26 遺伝子54 遺伝子48 遺伝子94 遺伝子44 kb21 kb141 kb35 kb255 コンアンプリコン濃縮151bp x2121bp x2150bp x2150bp x2150bp ��析アプリTruSight Tumor15Amplicon DSTruSeq AmpliconTruSeq AmpliconBWAEnrichmentTruSight Tumor15TruSight ��ード長36
対象とする遺伝子の比較TruSeq Amplicon Cancer (48 genes)TruSight Tumor 26TruSight Tumor 15RETGNA11AKT1BRAFALKAPCEGFRERBB2GNAQKITCDH1 FBXW7CTNNB1 K11ABL1 ERBB4 HNF1AKDRPTPN11RB1ATMFGFR1 HRASMLH1CDKN2A FGFR3 IDH1MPL SMARCB1CSF1RFLT3JAK2 NOTCH1SMOJAK3NPM1VHL37FOXL2MAP2K1MSH6
カスタムパネル製品TruSeq Custom Amplicon Low Input38
TruSeq Custom Amplicon Low �ンシーケンスNEW !TruSeq Custom AmpliconLow InputTruSeq Custom Ampliconv1.5gDNAインプット量10 ng50 ngFFPEインプット量10 ng 250 ��ズ16, 96 サンプル96 サンプル16 1,53616 10,000*150, 175, 250 bp150, 175, 250, 425 8,000円サンプルコスト �も含む）39
TruSeq Custom Amplicon Low Sample 1: 10ngSample 1: 0.0%30.0%
�� Captureアプリケーション Capture全ゲノムExome全ゲノムExome / TargetTargetTruSeq DNATruSeqExomeNextera DNATruSeq RapidExomeTruSeq Custom AmpliconTruSight OneTruSight PanelsTruSeq Amplicon Cancer(48 genes)TruSight Tumor (26 genes)TruSight ��ン生成100-1000ng100 ng1-50 ng50 ng30-300 ngFFPE対応NoNoNoNoYes / Noカスタム対応NoNoNoYesYes41
�ョンフィルタリングVariantStudioNextera RapidCapture ExomeTruSight �をサポート42
�リの選択BWA Enrichment v2.1① Project WindowでLaunch Appを選択する② BWA Enrichment v2.1を選択する43
製品スペック (x10以上のカバー領域 80%)Nextera Rapid Capture Exomeの場合
ゲノムブラウザ The Broad’s IGVBroad ��トを可視化45
�アント「IL1F10」と入力拡大/縮小46
�？アノテーションフィルタリング– 変異した塩基に関する情報付加– 疾患に関連しない変異を除外30,000 エクソン領域10,000 疾患関連遺伝子100 NHLBIExome Variant Server有害な変異10 稀47
�析アプリの選択VariantStudioの実行① Project WindowでLaunch �・64-bit Wndows OS(Wndows メモリ2GB以上・25 MB以上の空き領域② Variant Studioの実行48
��ン情報Annotation & Classificationタブから”Annotate”を選択 dbSNP 各人種集団でのアレル頻度 タンパク質構造への影響度 (SIFT、Polyphen) COSMIC: 癌由来の体細胞変異データベース �解析結果(VCFファイル)を選択49
�絞り込み
�BWA ポートの出力
メタゲノム解析52
メタゲノム解析 微生物を集団で解析する16s rRNA解析 微生物ゲノムの16s rRNA遺伝子のみをシーケンスする �生物に存在する 16s 生物を同定可能ショットガン解析 �スする �で期待できる53
16S rRNA 遺伝子配列とは？16S rRNAは1,542塩基長の原核生物 のリボソームRNAの一部である。 （真核生物の場合は18Sとなる）16S てプライマーをデザイン �ーケンスが可能。54
16S 検出感度が低いV4領域を囲む など）の増幅が困難55“Experimental and analytical tools for studying the humanmicrobiome” Kuczynski et al., Nat Rev Genet. 2011 Dec16;13(1):47-58
�プロジェクトEarth Microbiome �の糞便を解析。NIH Human Microbiome ��リファレンスを構築。NIH The Integrative HumanMicrobiome Project ��げMetaHIT56期間
菌叢解析の研究例肥満 菌叢の多様性が低い傾向 Chatelier E. et al, Nature (2013)糖尿病 マーカー遺伝子の同定 Junjie Qin et al, Nature (2012)大腸癌 マーカー菌種の同定 Zeller G et al, Mol Syst Biol. (2014) Zackular J et al. Can Prev Res. (2014)肝癌 肝癌誘発菌種の同定 Yoshimoto et al. Nature (2013)食生活 人工甘味料による耐糖能異常 Suez J. et al., Nature. (2014)Aymé Spor, Omry Koren & Ruth Ley, Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nature ReviewsMicrobiology 9, 279-290 (April 2011)57
��病C. difficile 染症膣カンジダ症Human microbiomes and their roles in dysbiosis, common diseases, and novel therapeutic approaches.Belizário JE and Napolitano M, Front Microbiol. 2015 Oct 6;6:1050.58
16S rRNA解析 ��460 ��イクル数で増幅し、Nextera カルに表示
16s領域をPCRで増幅60
16S iSeqを利用したプロトコール– V3-V4領域を含む460 bの領域をPCR増幅– シーケンス条件： 2x250–2x300– �トコール– �能なアダプター配列情報– �際の Tm値設定 ガイド61プロトコール(pdf): asupport/documents/documentation/chemistry de15044223-b.pdf
Earth Microbiome Project andard-protocols/62
16S菌叢解析用ライブラリー作製 : Tailed PCR 16S �在しない お客様ご自身でオリゴの合成 PCRを実施いただく必要がある63
32サンプルを1度に同時解析16S ンドで解析Qiime (J G caporaso, J Kuczynski, J stombaugh, et al., 2010) er 1Owner 2SoilHuman Samples MalawiWe thank Jeeff Gordon for the Malawi human fecal samples and Rob Knight for donation of the family studyhuman/canine host-associated samples from different body sites and soil samples.64
イルミナウェビナーシリーズ：16S ��http://www.illuminakk.co.jp/65
16S ��16S Metagenomics16S rRNA菌叢解析66Kraken Metagenomicsメタゲノム系統解析
�データシート：TruSeq PCRフリーDNAサンプル調製キット– Pub. No. 770-2013-J001 20MAR2013– ng/apac/japan/documents/pdf/datasheet truseq dna pcr-free sample prep-j.pdfデータシート：Nextera DNAサンプル調製キット– Pub. No. 770-2011-J021 07DEC11– ng/apac/japan/documents/pdf/datasheet nextera dna sample prep-j.pdfデータシート：TruSeq Custom Amplicon Low Inputライブラリー調製キット– Pub. No. 770-2015-J012 11DEC2015）– ng/apac/japan/documents/pdf/datasheet tru seq custom amplicon low input.pdfデータシート：Nextera メイトペアサンプル調製キット– Pub. No. 770-2012-J052 05MAR2013– ng/apac/japan/documents/pdf/datasheet nextera mate pair sample prep-j.pdf67
RNAシーケンス68
��興味があるYesNoTruSeq RNA Sample Prep Kit v2ncRNAにも興味があるNo FFPEサンプルを使用したいYesTruSeq Stranded mRNA Sample Prep �アのrRNAも除去したいNoTruSeq RNA Access Library Prep KitNoTruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R血液サンプルを使用したいNoTruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero GoldYesTruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Globin植物に興味があるTruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero PlantYesSmall RNAに興味がある69TruSeq Small RNA Sample Prep KitYes
ストランド情報ストランド情報：– 要性– �ることかできる– �� ATPH遺伝子発現（青色）の解析Total �タシート：TruSeq Stranded mRNA and Total RNA Sample Preparation Kit（Pub. No. roducts/datasheets/datasheet truseq stranded rna.pdf
遺伝子上でも、明確な定量が可能71
�ー作製原理RNA1st Strand cDNAの合成2nd Strand cDNA合成の際に dUTP を使用1st Strand cDNA2nd Strand cDNAアダプター付加3’DNAの増幅High Fidelity ��2nd Strand cDNAは増幅されず、1st Strand cDNA側からのみ増幅72
RNAライブラリー調製の主な方法Total RNATruSeq mRNATruSeq RNA �ラスター形成、シーケンス73TruSeq Total RNA
TruSeq RNAライブラリー調製の手順Total RNA から poly Aを含む mRNA を回収RNA � cDNA ��ーズによるサイズ選択A74TPCRA
RNAライブラリー調製の主な方法Total RNATruSeq mRNATruSeq RNA �ラスター形成、シーケンス75TruSeq Total RNA
TruSeq Total otal RNARNA ��ムプライマーを用いた cDNA 合成BBBdUTPを利用した2本鎖 cDNA �ビーズによるサイズ選択BBBBBBPCR76
TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero複数の Ribo-Zero に対応Ribo-Zero �ラットの ラットの rRNA除去（細胞質 ミトコンドリア）Plant植物の rRNA除去（細胞質 葉緑体）Globinグロビン mRNA除去77
PE78Fresh/Frozen
RNAライブラリー調製の主な方法Total RNATruSeq mRNATruSeq RNA 、シーケンス79TruSeq Total �、大量のシーケンスデータが必要
TruSeq RNA Accessライブラリー調製の手順RNA � cDNA 合成dUTPを利用した2本鎖 cDNA ーションPCRターゲット領域の濃縮PCR80
�タ比較TruSeq StrandedTotal RNA – 5億リードTruSeq StrandedTotal RNA6000万リードTruSeq RNAAccess5000万リードブローブ領域RefSeq �率よくシーケンスTruSeq Stranded Total RNATruSeq RNA Access81データシート：TruSeq RNA Access Library Preparation Kit（Pub. No. 470-2013-J004 pdf/datasheet truseq rna access library.pdf
�キットTruSeq mRNATruSeq RNA AccessTruSeq Total RNAmRNAmRNAmRNA & ��ランド情報NoYesYesYesTruSeq RNAv2TruSeq StrandedmRNATruSeq RNA AccessTruSeq Stranded TotalRNA100-1000ng100-4000 ng10-20 ng100-1000 �間8時間製品名Total RNAインプット量FFPE対応82
��イ解析有償オプションTruSeq mRNATruSeq RNA AccessTruSeq Total �をサポート83
��ントされたリードをカウント13,025 リード8,037 リードFKBP8 遺伝子発現84BrainUHRR3,115 リード31,109 リードRPS3 遺伝子発現BrainUHRR
ド85
タ量を揃える必要がある Fragments per kilobase of exon per million mapped sequence reads）FPKM ��おける100万リードあたりFPKM 量86
発現量比較用解析アプリの実行Cufflink Assembly& DE ��ロット87特定遺伝子の表示
�ルタリングsignificant “yes”log2(fold-change)でソート88
�ーTopHat Alignmentアライメント(TopHat ��(Isaac)Cufflink Assembly & �比較解析(Cuffdiff 2)発現定量(Cufflinks)
�データシート：TruSeq RNA Accessライブラリー調製キット– Pub. No. 470-2013-J004 01MAY2014– ng/apac/japan/documents/pdf/datasheet truseq rna access library.pdfウェビナー：RNA-Seq �び方 – ng/apac/japan/documents/pdf/2015 techsupport デザイン）– ng/apac/japan/documents/pdf/2014 techsupport session2.pdf90
TruSeq Custom Amplicon Low Input TruSeq Exome TruSeq Rapid Exome Nextera Rapid Capture Custom Enrichment TruSight Myeloid TruSeq RNA Stranded mRNA TruSeq Stranded Total RNA TruSeq Targeted RNA Panel TruSeq Small RNA TruSeq ChIP TruSight Tumor 15 Nextera DNA TruSeq Amplicon Caner Panel TruSeq RNA Access TruSight 疾患パネル �調製キット .
