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トラブルシューティング編TruSeq DNA & �おけるトラブルシューティングMarch 20, 2015小林 �ート部テクニカルアプリケーション サイエンティスト 2014 Illumina, Inc. All rights reserved.Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, GenomeAnalyzer, GenomeStudio, GoldenGate,HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iScan, iSelect, ForenSeq, MiSeq, MiSeqDx, MiSeqFGx, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina,SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq,TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, the pumpkin orange color, and the streaming bases design are trademarks ofIllumina, Inc. and/or its affiliate(s) in the U.S. and/orother countries. All other names, logos, and other trademarks are the property of their respective owners.

�ンナップのご紹介 今回ご案内するキットTruSeq DNAキット (PCR-free, Nano, ChIP)TruSeq RNAキット (RNA V2, Stranded mRNA/Total RNA)TruSeq DNAとTruSeq �価: ートツールのご案内6

TruSeqシリーズ、ラインナップ akk.co.jp/events/webinar japan.ilmn7DNAキットTruSeq DNA PCR-FreeTruSeq Nano DNATruSeq ChIPTruSeq Synthetic Long-ReadsTruSeq Custom Amplicon, TruSeq Cancer PanelRNAキットTruSeq RNA V2TruSeq Stranded mRNATruSeq Stranded total RNATruSeq Small RNATruSeq Targeted RNATruSeq RNA �さいTruSeq Methylation (旧EpiGnome、販売予定)TruSeq Ribo-profile (旧ART-seq 、販売予定)

RNAキット uSeqキットTruSeq DNA PCR-FreeTruSeq Nano DNATruSeq ChIPTruSeq RNA V2TruSeq Stranded mRNATruSeq Stranded total RNA共通点: させる。Y字アダプターSingle index (LT)Dual Index (HT)利点: ��端に異なるアダプターが結合する8

�部省略）Stranded mRNARNA V2Stranded Total RNARNA dT-purificationDNA PCR-freerRNA depletionRNA fragmentationNano DNA1st 2nd strand generation (dsDNA)DNA fragmentationChIPDNA PCR-freeNano DNAEnd-RepairSize ion to adaptersPCR amplificationOther library9DNA PCR-free library

DNATruSeq DNAキット (PCR-free, Nano, ChIP)- ワークフロー- Input DNA- 断片化- 最終ライブラリーのサイズ10

DNATruSeq DNAキットのワークフローの比較TruSeq DNA PCR-freeTruSeq Nano DNACovarisによるDNA断片化末端修復 1

DNAキットに用いるDNA (Input DNA)サンプル調製キット推奨Input DNA量TruSeq DNA PCR-Free1 µg genomic DNA (350bp inserts)2 µg genomic DNA (550bp inserts)TruSeq Nano DNA100 ng genomic DNA (350bp inserts)200 ng genomic DNA (550bp inserts)TruSeq ChIP5-10 ng ChIP サンプル用品質はA260/280nm: 。UV計測では、RNA, ssDNA, ��さい。- Qubit 2.0 Fluorometer（以降Qubit ります。Copyright 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. Used under permission.12

波破砕: 20, M220, ます。13

下記を確認ください。– �– 気泡が多く入っていないか？– �– さい。14015 100200850 [bp]長すぎ300500

DNAInput �い。– DNA量多い 断片長長い傾向– DNA量少ない があります。– �リンクにございます）– い。 A260/280nm: 1.8-2.0A260/230nm: tions-when-using-truseq15

DNA最終ライブラリーのサイズ- TruSeq Single Index (LTキット)のアダプターは122bp、Dual Index 16

DNA最終ライブラリーのサイズ- TruSeq ��ピーク17

�TruSeq NanoライブラリーとTruSeq ピーク18PCR-free700bp前後にピーク

�� 350bp(インサート長) 122bp（アダプター長） インサート長) �� 計594bpあたりにピーク得られる。Single Index (LTキット)のアダプターは122bpDual Index �19Quiz

りになります。– える点ご了承ください。20

RNATruSeq RNAキット(RNA V2, Stranded mRNA/Total RNA)- Workflow- Input material- Fragmentation21

RNATruSeq RNAキットのワークフローの比較TruSeq RNA V2TruSeq Stranded mRNAdTビーズでpolyA精製TruSeq Stranded Total RNARibo-ZeroビーズでrRNA除去22

RNAStrand Information: どちらの方向で読まれるか？R1 for antisense2nd StrandにのみcDNAにdUTPが入るR2 for sense2nd h-strand-in-the-truseq-stra23

RNAStrand Information: ASSp7p7’Read2Stranded mRNA libraryStranded Total RNA libraryRead2TruSeq RNA V2 librarymRNAキット、Total �情報を示す。出典: Datasheet: Stranded RNA kits24

��ライブラリーを作製したい。– どのキットがお勧めか？25TruSeq RNA V2TruSeq Stranded mRNATruSeq Stranded total RNATruSeq Small RNATruSeq Targeted RNATruSeq RNA Access

RNAQuizAns2:RNAキットTruSeq Stranded Total RNAか、TruSeq RNA Accessを使用ください。TruSeq RNA V2TruSeq Stranded mRNATruSeq Stranded total RNA: 分解RNA (FFPEなど)対応キットTruSeq Small RNATruSeq Targeted RNA : 分解RNA (FFPEなど)対応キットTruSeq RNA Access: 分解RNA �で回収することはできませんが(RNA V2とStranded tranded Total RNA) 。26

RNAキットに用いるRNA (Input ��は1 ug)クオリティーTruSeq Stranded mRNA0.1 - 4µg total RNA1)高品質(RIN 8)TruSeq Stranded Total RNA 0.1 - 1µg total RNA0.1 - 4µg total RNA1)TruSeq RNA v2RNA回収を迅速に行う高品質(RIN 8)定量はQubit/RiboGreenを使用する。– -freeの環境作る試薬を使用- 4µgのTotal ��。1)それぞれ0.1– トロールで検証必要）

RNAInput RNAのクオリティ:RNA Integrity Number �例Bioanalyzerで18S IN8以上のRNAサンプルを使用する(RNA V2とStranded lyzer for NGS slideshow.pdf28

94 )により行われます。デフォルトは94 , �くなります。29

�ります。– (RNA V2, Stranded mRNA, Total RNAとも)断片化がうまくいかない �因となります。– Input RNAが多すぎた– 反応時間、温度のコントロールが

TruSeq Custom Amplicon, TruSeq Cancer Panel TruSeq RNA V2 TruSeq Stranded mRNA TruSeq Stranded total RNA TruSeq Small RNA TruSeq Targeted RNA TruSeq RNA Access TruSeq Methylation (旧EpiGnome、販売予定) TruSeq Ribo-profile (旧ART-seq 、販売予定) DNA キット RNA キット その他 以前のウェビナー参照ください �のご .