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TEMA 6Polimorfismos genéticos humanos.Su importancia en farmacología y toxicología.Asociación con cáncer.Bases Bioquímicas de la Toxicología ClínicaRamiro JoverLos medicamentosson metabolizados(biotransformados)en nuestro organismoEl hígado es elórgano másimportante en lametabolización1

Metabolismo de medicamentos en el hígadoLos FÁRMACOSllegan al hígado porla vena portaHEPATOCITOSLos METABOLITOSsalen por la vena cavainferior o por la bilisLos medicamentos se metabolizan en los hepatocitosMETABOLITOSESTABLESFARMACO2

FASE IXENOBIOTICOSELIMINACIONFASE IIMetabolismo de Fármacos - Fase I y Fase IIXenobióticoFase IMetabolitoFase aciónS- y N-oxidación polar cetilaciónConjugación con SulfatoConjugación con GSHConjugación con AAsCYP&MEHCitotoxicidad DETOXIFICACION3

Metabolismo de fármacos - Fase I y Fase II5463NHNHNHClClClClConj.Sulfato3'4'ClClCYP- 2C95'COOHCOOHCOOHOH-OOSOOMetabolización del diclofenac (ruta principal)Metabolismo de xenobióticos - bioactivaciónEstimación del número de xenobióticos Pesticidas1500 Medicamentos6000 Aditivos de alimentos- con valor nutricional 2500- conservantes3000 Productos industriales tivationCytotoxicityGenotoxicity“Up to 80% of all human cancersare thought to arise from exposureto environmental agents”(Doll & Peto, 1981)4

XENOBIOTICBIOTRANSFORMATIONReactive metaboliteStable metaboliteGSHCONJUGATION DEPLETIONDetoxificationRedox cyclingOxidative stressLipidperoxidationAlteration ofCa2 INATIONAPOPTOSIS NECROSISIMMUNERESPONSE&GENOTOXICITY5

Metabolismo de xenobióticos - bioactivaciónEstimación del número de xenobióticos Pesticidas1500 Medicamentos6000 Aditivos de alimentos- con valor nutricional 2500- conservantes3000 Productos industriales tivation“Up to 80% of all human cancersare thought to arise from exposureto environmental agents”(Doll & Peto, 1981)CytotoxicityGenotoxicityFunciones del citocromo P450 (CYP) en el metabolismoFármacosHormonasesteroidesÁcidos ióticosCYPVitaminasLiposolublesAyDSales biliares6

Citocromo P450 (CYP) - Componentes del MNFADCitocromob5P450Retículo endoplásmicoRH O2 NADPH H ROH H2O NADP CYPs - Isoenzimas y nomenclaturaFamilias 40%1Subfamilias 1A1 1B1 55%1A22343A43A53A7 4A95781117192124 2721A24B14A114F24F311A111B111B22A6 2B6 2C8 2D6 2E1 2F12C92C182C197

CYPs - Abundancia relativa y am2C8- 93A4- BIDORESNifedipineErythromycin PhenacetinBufuralolCyclosporine CaffeineSparteineChlorzoxazoneCortisolTheophylline Debrisoquine Alcohols2D62E1Quinidine¿Tenemos todos el mismo patrón isoenzimático de CYPs?Variabilidad interindividual : Causassuccinil Co-A glicinaALA sintetasaGen-CYPácido d-aminolevulínicoALA deshidratasamRNAporfobilinógenoPBG desaminasaPorfiriasCo , Pb POLIMORFISMOSInductores químicosSeñales inflamatoriasHormonasDieta, etc.Citocromo P450apoproteínaprotoporfirina IXFeFerroquelatasaHEMOCYPInhibidores8

Variabilidad interindividual: utico2D6CYPNORMALFalloterapéuticoCYP2D6RAPIDO9

Variabilidad interindividual : ConsecuenciasBenzo-apyreneBenzo-apyreneB-a -pepoxideGSTM1CYP1A1MCYP1A1 ne-SGEl benzo-a-pireno seeliminaEl benzo-a-pireno seconvierte en un epóxidoreactivo que no seeliminaPOLIMORFISMOGenetic variations (difference in DNA sequence)occurring in more than 1% of a population.The term defines monogenetic traits that exist in thenormal population in at least two phenotypes, forexample the ABO blood groups.In the context of pharmacology, genetic polymorphismof drug metabolising enzymes gives rise to distinctsubgroups in the population that differ in their ability toperform a certain drug biotransformation.10

POLIMORFISMOÆ Variación genética Æ Cambio en la secuencia del DNA Æ MutacionesLas mutaciones, o variaciones en la expresión de los genes, pueden ocurrir conrelativa facilidad en las distintas fases del flujo de información CausasFactores endógenos: Errores en la maquinaria molecular.Factores ambientales: Radiaciones ultravioleta, alteraciones químicasproducidas por sustancias tóxicas, etc.Tipos de mutaciones puntuales :Sustitución:Adición (Inserción)Deleción- Silenciosas- De cambio de sentido- Sin sentido- Desplazamiento de la pauta de lecturaEl código genético11

Mutaciones del DNA. PuntualesSilenciosasDe cambio de sentidoSin sentidoMutaciones del DNA. Delección, adición y cambio en la pauta de lectura12

Mutaciones del DNA. Alteración en corte y empalme (splicing)Introducción de mutacionespuntuales por acción desulfonato de etilmentano(EMS), un agente mutagénicode uso común.Sustitución G Æ A13

POLIMORFISMOSFENOTIPACIÓN Y GENOTIPACIÓNMÉTODOS de FENOTIPACIÓN Medida directa de la actividad en tejido (biopsiahepática). Métodos ex vivo. Medida de actividad en cultivo delinfocitos. Métodos in vivo. Medida de un metabolito, relaciónmetabólica (Sustrato / Producto), o velocidad deeliminación, de un fármaco modelo:CYP1A2 Æ Cafeína (?)CYP2C9 Æ Tolbutamida, warfarinaCYP2C19ÆS-mefenitoina, omeprazolCYP2D6 Æ DextrometorfanCYP2E1 Æ Cloroxazona14

Fenotipo polimórfico: Hidroxilación de notipación. Detección de mutaciones puntuales. RFLP15

RFLP (Southernblot analysis)Genotipación. Single-strand conformation polymorphism (SSCP)16

Citocromos P450 polimórficos con relevancia en el metabolismo de xenobióticosCYPs humanos implicados en el metabolismo de carcinógenos17

CYPs humanos implicados en el metabolismo de carcinógenosCYP1A1Hidrocarburos aromáticos policíclicos(benzo(a)pireno & dimetilbenzantraceno)CYP1A2Nitrosaminas, aminas heterocíclicasCYP2A6Nitrosaminas, aflatoxina B1CYP2D6NNK (nitrosamina derivado en humo tabaco)CYP2E1Benzeno, tetracloruro de carbono, cloruro de viniloCYP3A4/5Aflatoxina B1, benzo(a)pireno, 6-aminocrisenoPolimorfismo del CYP2D6Polimorfismo de la debrisoquina / esparteinaEl 7% de la población presenta un metabolismo deficienteHerencia autosomal recesivaInfluye en la metabolización de mas de 25 fármacos de uso común:β-bloqueantes, antiarrítmicos, antidepresivos tricíclicos,antipsicóticos, analgésicos, antihistamínicos, etcNumber of sivemetabolizersPoormetabolizersDebrisoquine / 4-hydroxydebrisoquine18

Polimorfismo del CYP2D6CYP2D6 alleleDetrimentalmutation2D6-AAA2637 deleted2D6-BBConsequenceFrequency inCaucasian5-10G1934 Æ AReading framedisruptionDefect splicing2D6-DDGene deletionNo-enzyme10-152D6-EEA3023 Æ C1-52D6-TTT1795 deletedHis324Æ Prononfunctional prot.Reading framedisruption70-805-10Polimorfismo del CYP2D6CysN2D6-wtwtsignal anchorC (497)SRS1 SRS2 SRS3 SRS4N2D6-TT2D6-EESRS5SRS6C (152)SRS1Pro (324)CysNC (497)SRS1 SRS2 SRS3 SRS4SRS5SRS619

Polimorfismo del CYP2D6 y cáncer de pulmónNNK (4- (metilnitrosamina)- 1- (3- piridil)- 1- butanona)Nitrosamina identificada en el humo del tabaco (Crespi et al. 1991)Es activada (bioactivada) por CYP2D6Menos aductos DNA- nitrosamina en metabolizadores pobres 2D6Metabolizador pobre Æ fenotipo protectorNicotinaes sustrato del CYP2D6. Nicotina Æ cotininaMas nicotina en el plasma de metabolizadores pobres 2D6Menos necesidad (mayor duración efecto) Æ menos cigarrillosÆ Menos riesgo de cancerMetabolizador pobre Æ fenotipo rfismos del CYP1A1 y del receptor AhRPCytochrome EndoplasmicP450 1A1 ReticulumEnhancerPromoterTFIIXTBPTATAmRNANuclear RNA20

Polimorfismo del CYP1A1CYP1A1Polimorfismo del CYP1A1: Estudios fenotípicosActividad: hidroxilación de hidrocarburos aromáticos(benzo(a)pireno Æ 3-hidroxi-benzo(a)pireno)Tejido: linfocitos periféricos inducidos con -3MCo TCDDEn estudios poblacionales la actividad CYP1A1 muestra una distribucióntrimodal Æ Fenotipos: Baja, media y alta actividad / inducibilidadAsociación fenotipos 1A1 con carcinoma bronquial ÆAlta actividad% Controles:10.9% Pacientes:30.6Baja actividad42.25.021

Polimorfismo del CYP1A1: Estudios genotípicosIle / Val(462)polymorphic siteExon 123 4 567MspIpolymorphic siteAA-MspI polymorphic siteAlelosGenotipoFenotipoControlesCáncer pulmónm2 MspI m2/m2Alta Inducción10.622.9Val 462Val/ValAlta Actividad4.712.5Enzimas de Fase II implicadas en carcinógenesisGSTsNATsSulfotransferasasOtras enzimas implicadas en el metabolismo de carcinógenosAlcohol deshidrogenasaAldehido deshidrogenasaMicrosomal epoxido hidrolasaMieloperoxidasaNAD(P)H:quinona oxidoreductasa22

Glutation- S-transferasasGSTS (centro electrófilo) GSH- - ---------- S- SG Multifamilia de enzimas citsólicos mayoritariamente hepáticos. Presente en la mayoría de seres vivos. Protección contra compuestos nocivos.SUSTRATOS: Endógenos: Productos del estrés oxidativoPeroxidación lipídica Æ cumene hydroperoxide, 4-hidroxinonenalOxidación del DNA Æ Propenales básicos de timina y uracilo Exógenos: Carcinógenos ambientalesHAP bioactivados por P450 ( epóxidos, trans-4-fenil-3-buten-2-ona, benzo(a)pireno-diolepoxido) acroleina (humo tabaco), agentes metilantes (cloruro de metilo) pesticidas,disolventes industriales (oxido de etileno).Conjugación con glutation y su metabolismoGSH (γ-Glu -- Cys --Gly)23

Glutation-S-transferasas M2GSTM3GSTM4thetaM1*2 (57%)M1*AM1*B GSTT1M3*1piGSTP1T1*1T1*2 (20%)GSTT2M3*2GSTM5Glutation- S-transferasas humanas : Polimorfismos y cáncerCutaneous basal cell carcinoma (BCC):UV Æ ROS Æ mutationsGSTM1, GSTM3 y GSTT1 conjugan compuestos resultantes del estrés oxidativoinducido por UV.GST se expresa en la epidermis y en la lamina basal de la piel(que incluye las stem cells)Número promedio de BBCsSINOSkin type 12.992.12 GSTM1*2 (null) 4.572.00 GSTM3*1 (AA) 3.572.0824

- acetil- transferasas (NATs)NSustrato Ac-NATCoA-------------------- S- acetiladoSUSTRATOS:Endógenos: Aminas aromáticas endógenas como serotonina. Transferencia degrupos acetilo entre arilaminas endógenas (sin Ac-CoA). Son denominadas:Arilamina N-acetiltransferasasExógenos: Carcinógenos ambientales (Procesos industriales y combustion tabaco oalimentos). Aminas e hidrazinas aromáticas y heterocíclicas.- acetil- transferasas humanas: variantes alélicasNNAT1(7 alelos)GenesNAT2(15 alelos)1*41*101*141*111*15wtAlternat polyAArg187GlnVal149IleArg187Stop(Ç level) rapid(È affinity) slow(Ç Vmax) rapid(no NAT1) GluArg64Gln(È NAT2) slow(È stability) slow(È stability) slow(È stability) slow25

- acetil- transferasas humanas y cáncerNCáncerGenotipoColon: Bell et al. (1995)ControlesEnfermosRápidoPulmón: Bouchardy et al. (1998)ControlesEnfermosLentoHígado: Agúndez et al. (1996)ControlesEnfermosLentoNAT1% (n) ORNAT2% (n) OR29 (112) 1.044 (202) 1.956 (170) 1.066 (148) 1.954 (258) 1.068 (100) 1.8ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS. Medidas de asociación.ODDS de que nazca un niño:nº niños 51 / nº niñas 49 1.04RISK de que nazca un niño:nº niños 51 / (tot 100) 0.51ODDS RATIO:ODDS control 1.04ODDS india 1.70 (63/37)OR 1.70 / 1.04 1.63RELATIVE RISKRISK control 0.51RISK india 0.63 (63/100)RR 0.63 / 0.51 1.2426

Nitrosamina identificada en el humo del tabaco (Crespi et al. 1991) Es activada (bioactivada) por CYP2D6 Menos aductos DNA- nitrosamina en metabolizadores pobres 2D6 Metabolizador pobre Æfenotipo protector Nicotina es sustrato del CYP2D6. Nicotina Æcotinina Mas nicotina en el plasma de metabolizadores pobres 2D6 Menos necesidad (mayor duración efecto) Æmenos cigarrillos ÆMenos