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TOBIAS JANKEMOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN ZURPILZDIVERSITÄT IN STALL- UND HAUSSTAUBPROBENMITTELS PCR-SSCP UND PARALLELSEQUENZIERUNG
Technische Universität MünchenLehrstuhl für TierhygieneMolekularbiologische Untersuchungen zurPilzdiversität in Stall- und Hausstaubprobenmittels PCR-SSCP und ParallelsequenzierungTobias JankeVollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephanfür Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zurErlangung des akademischen Grades einesDoktors der Naturwissenschaftengenehmigten Dissertation.Vorsitzender:Prüfer der Dissertation:Univ.-Prof. Dr. S. Scherer1.Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. J. Bauer2.Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. E. von Mutius(Ludwig-Maximilians-Universität München)Die Dissertation wurde am 22.05.2013 bei der Technischen Universität Müncheneingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 05.09.2013 angenommen.
2014 by Tobias Janke, München, DeutschlandAlle Rechte, auch die der Übersetzung und des Nachdrucks sowie jede Art derphotomechanischen Wiedergabe oder der Übernahme auf Datenträger, auchauszugsweise, bleiben vorbehalten.Technische Universität MünchenLehrstuhl für TierhygieneWeihenstephaner Berg 3D-85354 FreisingHerstellung: Hieronymus Verlag, NeuriedEine elektronische Version der Dissertation ist im Netz der Universitätsbibliothek derTechnischen Universität München veröffentlicht und unter der Internetadressehttp://mediatum.ub.tum.de zu finden.
Im Gedenken an meine Mutter24.08.1949 – 21.01.2012„Ja, das Alles auf Ehr‘,Das kann ich und noch mehr,Wenn man kann’s ungefähr,Ist’s nicht schwer – ist’s nicht schwer!“Zigeunerbaron, Johann Strauss, 1885
INHALTSVERZEICHNISIInhaltsverzeichnisI Abkürzungsverzeichnis . VII Tabellenverzeichnis . VIIIIII Abbildungsverzeichnis . XIII1Einleitung. 12Literaturübersicht . 32.1Pilze . 32.1.1Biologie und systematische Klassifizierung . 32.1.2Pilze in der Umwelt . 62.1.3Pilze als Humanpathogene . 92.1.4Zusammenhänge zwischen Pilzexposition und Asthmaprävalenz . 152.2Qualitativer und quantitativer Nachweis von Pilzen . 172.2.1Direktmikroskopie . 172.2.2Kulturelle Nachweisverfahren . 182.2.3Kulturunabhängige Nachweisverfahren . 183Material und Methoden . 313.1Material . 313.1.1Pilzspezies . 313.1.2Probenmaterial. 333.1.3Technische Geräte . 343.1.4Verbrauchsmaterial . 363.1.5Chemikalien . 373.1.6Herstellung der Gebrauchsmedien . 393.2Methoden . 433.2.1Allgemeine mikrobiologische Methoden . 433.2.2Allgemeine molekularbiologische Methoden . 44
IIINHALTSVERZEICHNIS3.2.3Adaption der Basismethoden an die Untersuchung vonPilzgemeinschaften in der Matrix Staub . 523.2.4PCR-SSCP zur Untersuchung von Pilzgemeinschaften in Staubproben(Darstellung der validierten Endmethode) . 603.2.5Untersuchung der Pilzdiversität in Stall- und Hausstaubproben . 623.2.6Molekularepidemiologische Untersuchungen zur Assoziation zwischenSchimmelpilzexposition und Asthmarisiko bei Schulkindern (GABRIEL). 634Ergebnisse . 694.1Adaption der PCR-SSCP Basismethode an die Untersuchung vonPilzgemeinschaften in Stall- und Hausstaubproben . 694.1.1Gezielte Auswahl und Evaluierung eines geeigneten Primerpaares . 694.1.2Auswahl eines geeigneten DNA-Extraktionsverfahrens . 784.1.3Entwicklung eines PCR-SSCP-Pilz-Speziesstandards („Spec“) . 814.1.4Reproduzierbarkeit der entwickelten PCR-SSCP-Methode . 824.2Untersuchung der Pilzdiversität in Stall- und Hausstaubproben . 864.2.1PCR-SSCP-Analyse . 864.2.2Kulturelle Untersuchungen . 884.2.3Parallelsequenzierung . 894.2.4Vergleich von PCR-SSCP-Analyse, Parallelsequenzierung undkulturellen Untersuchungen von Stall- und Hausstaubproben . 934.3Molekularepidemiologische Untersuchungen zur Feststellung vonAssoziationen zwischen Schimmelpilzexposition und Asthmarisiko beiSchulkindern (GABRIEL) . 944.3.1PCR-SSCP-Analyse von Matratzenstaubproben (GABRIEL) . 944.3.2Parallelsequenzierung von Matratzenstaubproben (GABRIEL) –Pilotversuch . 123
INHALTSVERZEICHNIS5IIIDiskussion . 1315.1Adaption der PCR-SSCP-Analysemethode und derParallelsequenzierungstechnologie an die Untersuchung von Stall- undHausstaubproben . 1315.1.1DNA-Extraktionsverfahren . 1315.1.2Primerauswahl . 1335.1.3Kulturunabhängige Untersuchungen von Pilzgemeinschaften mittelsPCR-SSCP . 1385.1.45.2Quantitative Bestimmung der Pilzexposition . 142Untersuchungen zur Pilzdiversität in Stall- und Hausstaubproben . 1435.2.1Kultivierungsversuche . 1435.2.2PCR-SSCP-Analyse und Sanger-Sequenzierung . 1445.2.3Parallelsequenzierung zur Bestimmung der Pilzdiversität in Stall- undHausstaubproben. 1465.3Molekularepidemiologische Untersuchungen zur Feststellung vonAssoziationen zwischen Schimmelpilzexposition und Asthmarisiko beiSchulkindern (GABRIEL) . 1505.3.1PCR-SSCP-Analyse und Sequenzierung . 1515.3.2Parallelsequenzierung von Matratzenstaubproben zur Ermittlung derDiversität und der Assoziation spezifischer Sequenzen bezüglich Asthma. 1626Schlussfolgerungen und Ausblick . 1677Zusammenfassung . 1698Summary . 1719Literaturverzeichnis . 173
IVINHALTSVERZEICHNIS10Anhang . 20710.1 Anhang A: Tabellen . 20710.1.1 Anhang A1: Bestimmung der Ähnlichkeiten von SSCP-Bandenprofilen(Pearson Korrelations-Koeffizient (%)) von jeweils einer Staubprobeunterschiedlicher Herkunft) . 20710.1.2 Anhang A2: Darstellung erhaltener Sequenzen aus Sanger- undParallelsequenzierung . 21310.2 Anhang B: Abbildungen . 24610.2.1 Anhang B1: DNA-Extraktionsverfahren . 24610.2.2 Anhang B2: DNA-Aufreinigungsverfahren . 24910.2.3 Anhang B3: Next Generation Sequencing . 25210.2.4 Anhang B4: Detektion von amplifizierter DNA mittelsAgarosegelelektrophorese . 26011Danksagung . 26712Erklärung . 26913Curriculum Vitae . 270
ABKÜRZUNGSVERZEICHNISVI Abkürzungsverzeichnis%Prozent CGrad mated RibosomalIntergenic Spacer Analysis (engl., Automatisierte RibosomaleIntergenic Spacer Analyse)CFUColony Forming Units(engl., ndriale Cytochromc Oxidase Untereinheit 1COPDChronic obstructivepulmonary disease turierendeGradientenGelelektrophoresed.h.das heißtDi.DioszegiaDNADesoxyribonucleic acid,(engl. bares Wasser ineinem bidestilliertes elsträngige DNAbzw.beziehungsweiseDSMZC.CandidaE.Deutsche Sammlung vonMikroorganismen atemPCREmulsions-PCR (s.a.PCR)EPAEnvironmental ProtectionAgency (engl., Umweltschutzbehörde)ca.Ca2 CBSKNAWBasic Local AlignmentSearch ToolcircaCalcium-IonenCentraalbureau voorSchimmelcultures, Institutder Königlich-Niederländischen Akademie fürKunst und Wissenschaften
RMIEnvironmental RelativeMoldiness Index (engl.,Index zur Beurteilung drogenaseLFLLandesanstalt fürLandwirtschaftLSUlarge-subunit (engl.,große Untereinheit)m, µmilli-, mikro-MMolarMDEMutation DetectionEnhancementMIDMultiplex IdentifierminMinuteMSQPCRMold-specific qPCR,(engl., Schimmelpilzspezifische, quantitativePCR)MVOCMicrobial, volatile, organiccompound (engl., mikrobielle, volatile, iumcarbonatNaOHNatriumhydroxidNCBINational Center forBiotechnology InformationnNano-NGSNext GenerationSequencingntNukleotidODTSOrganic dust toxicsyndrome (engl.,toxisches Syndrom,ausgelöst durch Kontaktmit organischem Staub)OROdds ratio (engl.Kreuzproduktverhältnis)OTUOperating Taxonomic Unitppiko-et al.et alteri (lat., und äre Studiezur Identifikation dergenetischen undumweltbeeinflusstenUrsachen für Asthma inder EuropäischenGemeinschaftGLBGel-Loading-Buffer (engl.,Gelladungspuffer)GyGray (pro Masseabsorbierte ICBNInternationaler Code derbotanischen NomenklaturImmunglobulin, z.B. IgA,IgE, IgGIgIGSIntergenic spacerILInterleukinITSInternal akilo-DaltonKilo-Basen
RPolymerase-ChainReaction .TabelleTBETris-Borsäure-Puffer phoreseTNFTumornekrosefaktorT-RFLPRibosomal IntergenicSpacer Analysis (engl.,Ribosomale IntergenicSpacer Analyse)Terminaler sfer-RNATUMrounds per minute (engl.,Umdrehungen proMinute)Technische UniversitätMünchenUUnit (engl., Enzymeinheit)u.a.unter anderemUKUnterklasseusw.und so weiteruvm.und viele mehrVVoltv.a.vor allemW.WallemiaWHOWorld Health Organization (engl., Weltgesundheitsorganisation)WHSWorld Health Survey(engl., Weltgesundheitsstudie)z.B.zum Beispielz.T.zum TeilPh.PhomaPi.PichiaPs.PseudotaeniolinaT
tRNA Transfer-RNA TUM Technische Universität München U Unit (engl., Enzymeinheit) u.a. unter anderem UK Unterklasse usw. und so weiter uvm. und viele mehr V Volt v.a. vor allem W. Wallemia WHO World Health Organi - zation (engl., Weltgesund-heitsorganisation) WHS World Health Survey (engl., Weltgesund - heitsstudie) z.B. zum Beispiel
