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Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaTEMA 10REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN1.Introducción2. El ADN como portador de la información genéntica3 Herencia y replicación del ADN4. Transcripción y ARN5. Código genético y traducción. Síntesis de proteínas1. IntroducciónEn este tema estudiamos el metabolismo de los ácidos nucleicos y la síntesis deproteínas, explicaremos como la información genética se transmite de unageneración a otra con absoluta fidelidad, pero a la vez que permite pequeñoscambios en el material genético para que tenga lugar la evolución. Y descubrimoscomo esta información genética se transcribe a ARNm y se expresa en último lugaren la secuencia de aminoácidos de una asombrosa variedad de moléculas proteícas.Mientras que en las reacciones del metabolismo intermediario solo la estructuratridimensional de la enzima condicionaba la reacción, los substratos o inhibidoresque actuarán. Las reacciones que encontramos en el metabolismo de la informacióngenética, se caracterizan por la necesidad de un molde que actúa junto a la enzima,para especificar la reacción catalizada.2. El ADN como portador de la información genéticaYa en el S XIX se conocía que en el núcleo celular había una sustancia, la nucleina,formada por una parte ácida (hoy ADN) y una parte básica (hoy proteína). Pero fueentre 1944 y 1952, cuando una serie de experimentos cruciales apuntaron claramenteal DNA como el material genético. Antes de esta fecha los ácidos nucleicos seconsideraban demasiado simples, estaban formados simplemente por 4 clases demonómeros y se consideraron simplemente como una sustancia estructural del núcleocelular. Se consideraba más probable que los genes estuvieran formados por proteínas,que eran moléculas mucho más complejasEn 1944 Avery y sus colaboradores descrubrieron que el ADN extraído de cepaspatógenas de la bacteria Streptococcus Pneumoniae podía transferirse a cepas no106
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicapatógenas, transformándolas en patógenas. Este experimento consistía en inocularratones con células de pneumococcus (S) patógenas que moriían y células (R) nopatógenas que permitían que el ratón permaneciera vivo. Si las bacterias patógenas(S) se sometían a calentamiento perdían su virulencia. Si se incubaban las bacteriasno patógenas (R) con ADN extraido de las bacterías patógenas, y se inoculban losratones con estas bacterias, los ratones morían. Parece como si la cepa no virulentarecibiera algo de las bacterias patógenas. Avery y sus colegas concluyeron que elDNA extraído de la estirpe virulena portaba el mensaje hereditario de la virulencia.Algunos científicos mantenían que las proteínas presentes en el DNA comoimpurezas podrían ser responsables de este cambio genético. Esta posibilidad fueeliminada al encontrar que el tratamiento del DNA con ezimas proteolíticas nodestruia las propiedades transforadoras del ADN, mientras que el tratamiento connucleasas si lo hacía.Un segundo expreimento independiente proporcionó la evidencia definitiva. Herseyand Chase (1952) demostraron, mediante el experimento de la batidora, el papel delADN. Para esto usaron en fago T2, que solo tiene ADN y las proteínas de la cápsida.Marcaron radioactivamente dos muestras de fago T2. En el primer caso lasproteínas del fago T2 con S35 y en segundo el ADN con P32 (las proteínas no tienenP y los nucleicos no tienen S). Estas muestras se usaron para infectar muestrasseparadas de bacterias. Las suspensiones bacterianas se agitaron con una batidoray las capsidas se separaron de las bacterias por centrifugación. Solo las bacteriasinfectadas con virus marcados con P32 tenían radiactividad, indicando que era elADN el agente infectante. En el otro caso la radiactividad quedaba en elsobrenadante donde estaban las cápsidas marcadas con S353. Herencia y replicación del ADNEl ADN posee la información necesaria para transmitir los caracteres de una especiede generación en generación y conseguir la supervivencia de la especie. Por lo tantola molécula de ADN constituye la base química de la herencia. La mayoría de lasmoléculas de ADN se encuentran en los cromosomas del núcleo de las células. Elnúmero de cromosomas depende de la especie, así por ejemplo, las bacteriasposeen un único cromosoma, mientras que las células humanas poseen 46 (23 decada progenitor). La información genética en forma de ADN se organizaestructuralmente dentro del cromosoma arrollándose alrededor de ciertas proteínas107
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímica(histonas) constituyendo asociaciones ADN-proteína denominadas nucleosomas(Figura 1).Las cadenas de ADN de cada especie difieren en longitud y en la secuencia de lasbases nitrogenadas, de tal manera que esta secuencia contiene la informacióngenética característica de cada especie. La información genética debe reproducirseexactamente cada vez que la célula se divide. El proceso por el que las moléculasde ADN se copian a si mismas en el núcleo de las células recibe el nombre dereplicación del ADN. La replicación pretende a partir de una cadena de ADNobtener dos iguales.Figura 1.Organización estructural del ADNen el cromosoma.3.1. Principales características de la replicación108
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaLas características principales del proceso son: su carácter semiconservador, larealización simultanea en ambas hebras, de forma secuencial y con carácterbidireccional y origen monfocal (procariotas) o multifocal (eucariotas).Semiconservador. Es decir cada hebra sirve como molde para la síntesis de unanueva cadena, produciendo dos nuevas moléculas de ADN, cada una con una de lashebras viejas y una nueva hebra hija. Esta hipótesis fue propuesta pro Watson andCrick poco después de la publicación del modelo de la doble hélice, y fue probadodefinitivamente por los ingeniosos experimentos diseñados por Meselson and Stahlen 1957.Solo caben tres posibles hipóteisis para explicar el mecanismo de la repiclación:conservadora (las dos hebras se copiaran para dar una nueva molécula, de formaque el ADN progenitor permanece intacto y el ADN hijo tendría dos hebras nueva),dispersante (el ADN progenitor se rompería antes de que se sintetizaran los nuevosfragmentos de ADN, estos luego se unirían a los fragmentos originales para dar ADNhijos con fragmentos tanto nuevos como de las dos hebras del progenitor) ysemiconservadora (Las dos nuevas moléculas de ADN formadas tienen cada unauna hebra vieja y una hebra nueva).Meselson and Stahl cultivaron células de E.coli en medio con N15 (isótopo pesadode N14) durante muchas generaciones, hasta que todo el ADN de E. coli estuvieramarcado con N15. El ADN aislado de estas células tenía una densidad un 1% mayorque el ADN normal con N14. Esta pequeña diferencia puede apreciarse en unacentrifugación en gradiente de densidad CsCl.Las céluas de E. coli cultivadas con N15 se transfierieron a medio fresco con N14, yse dejaron crecer durante el tiempo suficiente para que la población se duplicara. ElADN aislado de estas células formaba una sola banda en la centrifugación engradiente. Esto eliminaba al hipótesis de la replicación conservadora. Si las célulasde E. coli se dejaban en el medio fresco con N14 durante dos generaciones seobservaban en la centrifugacion en gradiente dos bandas. Una con la densidadcorrespondiente al ADN ligero y otra con la densidad del ADN mixto obtenido en la109
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaprimera generación. Esto descartaba también la hipótesis dispersante y confirmabala replicación semiconservativa como la única hipótesis posible.Bidireccional. La separación de las hebras progenitoras que comienza en cadaorigen de replicación progresa en ambas direcciones. Los puntos de transición entrela doble hebra y las hebras sencillas se llaman horquillas de replicación y vanalejándose entre si. Estos datos se obtuvieron utilizando el marcaje isotópico delADN con Titrio H3. El ADN marcado, aislado y expuesto a una emulsión photográficadurante semanas podía fotografiarse. Si el titrio se añadia durante un corto períodode tiempo y la reacción se paraba observando los autoradiogramas podíaobservarse que el ADN marcada aparecía a ambos lados de la horquilla dereplicación.El inicio de la replicación en procariotas es monofocal, comienza siempre en unpunto determinado del cromosoma circular denominado origen (ORI). La replicaciónprogresa formando dos horquillas de replicación. Por el contrario en eucariotas lareplicación es multifocal, pues en cada cromosoma existen múltiples orígenes dereplicación (cientos o miles) que dan lugar a un número doble de horquillas dereplicación. Esto permite completar la replicación de los cromosomas en un tiemporazonable. Esto puede visualizarse mediante microscopia electrónica. Vemos comola replicación de un cromosoma circular se inicia un punto en concreto y essimultanea (las dos hebras se replican a la vez).En algunas autoradiogramas se ve más de un nuevo ciclo de replicación a la vez.Esto ocurre porque para la replicación completa del cromosoma hace falta un tiempoque por lo general es superior al de la fase S del ciclo celular que es donde tienelugar la replicación del ADN. De forma que una molécula de ADN en replicaciónpuede iniciar un nuevo ciclo de replicación desde el origen recien formado antes deque se complete la replicación que se está produciendo. De forma que cuando lacélula se divide cada célula hija recibe un cromosoma que ha avanzado yaconsiderablemente en el siguiente ciclo de replicación.110
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaSemidiscontinuo. Como veremos más adelante la síntesis de la nueva cadena tienesiempre lugar en el sentido 5 -3 , siendo el grupo 3 OH el punto por el cual el ADNes elongado. Esto es válido para todas las polimerasas tanto la ADN como las ARNpolimerasas. Si las dos hebras son antiparalelas, como pueden las dos hebras sersintetizadas de manera continua mientras progresa la horquilla de replicación. Lasolución que la célula adopta ante este problema fue descubierta por Okazaki. Quedescubrió que una de las hebras era sintetizada en pequeños fragmentos llamadosfragmentos de okazaki. Por lo tanto una de las hebras es sintetizada de formacontinua, y la otra de forma discontinua. La longitud de los fragmentos de okazakipuede variar desde unos cientos de nucleótidos hasta unos miles, según el tipo decélula.3.2. Pasos de la replicación del ADN en eucariotasLa replicación se lleva a cabo gracias a la ADN polimerasa III, esta enzima catalizala unión de los desoxinucleótidos trifosfato que son abundantes en el fluido delnúcleo celular. Estos desoxinucleótidos trifosfato se desplazan hacia la partedesenrollada de la molécula de ADN y se colocan por complementariedad enfrentede la base que les corresponde (A T; C G) de la cadena que actúa como molde, yuna vez que están en el sitio adecuado se unen entre si por acción de la polimerasaIII. La adición de dos unidades nucleótidicas consecutivas tiene lugar mediante launión del grupo hidroxilo del carbono 3 de un nucleótido con el grupo fosfato delextremo 5 del siguiente. El mecanismo por el que se produce esta unión es unataque nucleofílico del grupo 3 -OH de un nucleótido al 5 -trifosfato del nulceótidoadyacente, eliminándose el pirofosfato y formándose un enlace fosfodiéster. Lapolimerasa lee la hebra que hace de molde en el sentido 3 5 y sintetiza la nuevahebra en el sentido 5 3 . Esta enzima necesita para iniciar la síntesis un pequeñofragmento de nucleótidos que denominamos cebador. En la síntesis del cebadorinterviene un tipo de ARN polimerasa denominado primasa.Durante el proceso de replicación, una de las cadenas madre se lee “bien” (ensentido 3 5 ) y, por lo tanto, la nueva cadena se sintetiza de corrido (hebraconductora), pero la otra está dispuesta en sentido contrario al que la polimerasapuede leer (hebra retardada). La solución a este problema es sintetizar la cadena enpequeños fragmentos en el sentido 5 3 . Los cebadores son luego eliminados porla acción exonucleasa de la ADN polimerasa tipo I y los nuevos fragmentosresultantes son unidos por la acción de la ligasa, que elimina las mellas que quedan111
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaentre fragmentos. La secuencia de pasos implicados la replicación del ADN puederesumirse como sigue (Figura 2):--Apertura de la doble hélice del ADN por acción de las helicasas.Sintesis de los cebadores para que la ADN polimerasa pueda actuar. Lasenzimas implicadas denominan primasas.Se inicia la polimerización por acción de la ADN polimerasa IIICuando se alcanza el cebador del fragmento sintetizado anteriormente laPolimerasa I sustituye a la Pol III y, haciendo uso simultáneo de sus actividadesexonucleasa (degradadadora de nucleótidos) y polimerasa, va sustituyendo loscebadores por el ADN correspondiente.Las ligasas cierran las mellas que hay entre cada dos fragmentos.Figura 2.Visión general del proceso dereplicación del ADN.4. Transcripción y ARNLa transcripción consiste en la formación de una molécula de ARN a partir de lainformación genética contenida en un segmento de ADN. Es decir da lugar ana copiade ARN con secuencia complementaria y antiparalela, a partir de una secuenciamolde en una de las hebras del ADN. Mientras que en la replicación se copia el112
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicacromosoma entero, la transcripción es más selectiva. En un momento dado solo sontranscritos ciertos genes o grupos de genes. La célula restringe la expresión de laexpresiónde la información genética a la formación de los productos génicosnecesarios en cada momento, en un proceso finamente regulado por secuenciasreguladoras especificas que indican el principio y el fin de los segmentos que debenser trascritos. Estos procesos regulatorios serán estudiados con detalle en los temassiguientes.Existen tres clases principales de ARN. El mensajero que codifica la secuencia deaminácidos de uno o más polipéptidos especificados por un gen. El ARNtrasnferente que lee la información codificada en el ARNm y transfiere el amoniácidoadecuado a la cadena polipéptidica en crecimiento durante la síntesis proteica y elARN ribosómico que forma parte de los ribosomas, las complejas máquinariascelulares donde se sintetizan las proteínasEl proceso empieza cuando la ARN polimerasa se une a unas secuenciasespecíficas llamadas promotores. La doble hélice del ADN se desenrrolla formado elbucle de transcripción (unos 17 nucleótidos) para servir de molde para la síntesis delARN, de tal manera que solamente una de las dos cadenas es la que transcribe lainformación al ARN. La cadena de ADN que sirve de molde se denomina ”cadenamolde”, mientras que la complementaria se llama “cadena codificante”, identica ensecuencia de bases al ARN transcrito excepto que la timina es sustituida por uracilo.Los ribonucleótidos trifosfato existentes en el fluido celular (ATP, GTP, CTP y UTP)se desplazan hacia la parte desenrollada de la doble hélice del ADN y se sitúancomplementando la cadena (T A; A U; C G). Cuando estos nucleótidos seencuentran adecuadamente situados se unen entre si por acción de la enzima ARNpolimerasa (en el sentido 5 3 ). Finalmente, el ARN se separa y el ADN recuperala estructura de doble hélice. El ARNm así formado sufre pocas modificaciones en acinespostranscripcionales en el caso de los eucariotas, eliminándose los intrones(secuencias del genoma que no codifican nada), formando así el ARNm maduro quese traducirá en proteínas. El ADN se utiliza también como molde para la síntesis delos otros dos tipos de ARN, el transferente y el ribosómico.Las principales diferencias entre el proceso de trancripción en procariotas yeucariotas pueden resumirse como sigue:-En procariotas no hay separación física entre transcripción y traducción, mientrasque en los eucariotas la transcripción tiene lugar en el núcleo, donde está elADN, y la traducción en el citoplasma donde están los ribosomas.113
Tema 10. Replicación, transcripción y traducción--BioquímicaEn procariotas los ARNm son policistrónicos (llevan varios genes) y en eucariotaspor lo general son monocistrónicos.En procariotas hay un solo tipo de ARN polimerasa, mientras que en eucariotashay al menos 3 tipos de ARN polimeras distintas (una para cada tipo de ARN).En Procariotas los ARNm sufren pocas modificaciones postranscripcionales,mientras que en eucariotas sufren muchas, entre ellas la eliminación de intrones.Figura 3.Visión general del proceso detranscripción del ADN.La ARN polimerasa necesita al igual que la ADN polimerasa los cuatro nucleótidostrifosfato (ATP, GTP, CTP, UTP), Mg2 y la cadena patrón de ADN cuya secuenciadeterminará la del ARN, pero a diferencia de la ADN polimerasa no necesita cebadorpara iniciar la síntesis de la cadena (Figura 3). La ARN polimerasa al igual que laADN polimerasa sólo lee en el sentido 3 5 y sintetiza la nueva hebra en elsentido 5 3 . La primera etapa del proceso de transcripción es la unión de la ARNpolimerasa a la molécula de ADN; esta unión se produce por unas zonas específicasdel ADN denominadas promotores, que indican a la enzima que tiene que empezar atranscribir. El reconocimiento del promotor es un paso crucial de la transcripción,tanto en lo que se refiere al mecanismo como para la regulación de la transcripción,como veremos en el próximo tema. También la terminación obedece a ciertassecuencias específicas denominadas secuencias de terminación.114
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaLos promotores son zonas específicas del ADN donde se une la ARN polimerasapara empezar la transcripción, y dirigen la transcripción de los genes adyacentes.Las secuencias de los promotores no son idénticas pero se han encontrado enmuchas bacterias ciertas secuencias que son particularmente comunes en ciertasposiciones (secuencia consenso). Se sitúan unos 10 y 35 nucleótidos a la izquierdade donde se inicia la transcripción y se llaman secuencia –35 o caja de entrada ysecuencia –10 o caja TATA (Figura 4).Figura 4.Visión de la región del promotoren el ADN. Tipos de ARNp ribosómico son bastantes estables, pero el mensajero es extremamente inestable,tiene una vida media de segundos.ARN Ribosómico. Los ribosomas son orgánulos intracelulares donde tiene lugar lasíntesis de proteínas. Están formados por tres tipos de ARN y varias proteínasdiferentes, incluyendo todas la enzimas necesarias para la traducción. Los ARNr soncomponentes estructurales de los ribosomas y también hay una serie RNAribosómicos con funciones especiales incluyendo actividad catalítica (ribozimas).En procariotas. Ribosomas 70s:115
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaSubunidad 30s con 21 proteínas diferentes y 16s RNASubunidad 50s con 22 proteínas diferentes y 23s RNA y 5s RNAEn eucariotas. Ribosomas 80s:Subunidad 40s con 33 proteínas diferentes y 18s RNASubunidad 60s con 45 proteínas diferentes y 5.8s, 28s y 5s RNAARN Transferente. Los aminoácidos se alinean frente al molde de RNAm durante lasíntesis de proteínas gracias a los tRNA que son capaces de leer los codones delARNm y colocar el aminoácido correspondiente en el polipéptido. Estructuralementetiene forma de trebol.ARN Mensajero. Es el único que puede usarse como molde para la traducción aproteínas. Ni el rRNA ni el t RNA sirven para este fin. Son poco estables, tienen unavida media muy corta, sería “antieconómico” para la célula tener muchos.5. Código genético y traducción. Síntesis de proteínasLa traducción es un proceso muy complejo con un elevado coste energético(consume el 90% de la energía de la biosíntesis) y con necesidad de una estrechade regulación. Es sin duda el proceso de síntesis en que participa mayor número demacromeléculas diferentes. Las principales son:. Al menos 32 tipos de ARNt portadores de aminoácidos. Ribosomas (formados por unas 70 proteinas y 5 ARNr difentes). Un ARNm molde. Mas de una docena de enzimas y factores proteicos adicionales para asistir alinicio, elongación y terminación. Unas 100 proteinas adicionales para la modificación de las distintas proteinasEn total mas de 300 macromoléculas diferentesComo hemos visto antes, el ADN es el molde mediante el cual la informacióngenética necesaria para la síntesis de proteínas se transcribe al ARNm. Una vezformado, el ARNm sale del núcleo y se dirige a los ribosomas donde tendrá lugar lasíntesis proteíca. La traducción se realiza utilizando una secuencia específica de tresbases del ARNm llamada triplete de bases o codón. Cada aminoácido está116
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicacodificado por, al menos un triplete, que constituyen en código genético y que serecogen en la Figura 5. Este código es universal (válido para todas las especies) yredundante (un aminoácido puede estar codificado por varios codones), pero no esambiguo (un codón codifica uno y sólo un aminácido).La traducción del ARNm tiene lugar en los ribosomas y sigue los mismos pasos enprocariotas y eucariotas. Cada triplete de nucleótidos o codón del ARNm determinaun aminoácido específico. Cada molécula de ARNt porta el aminoácidocorrespondiente a un codón. El reconocimiento entre el ARNt y el codón tiene lugargracias al anticodón. Entre los dos aminoácidos consecutivos debe formarse elenlace peptídico, este paso está catalizado por la enzima peptidil transferasa. Luegoel ribosoma se transloca, desplazandose a lo largo de la cadena peptídica que seestá formando y dejando un sitio vacante para un nuevo ARNt-aminoácido. Latraducción continúa hasta que aparece un codón de terminación.El desciframiento del código genético fue un trabajo complejo y se ha considerado elmayor descubrimiento científico del SXX. Fundamentalmente se baso en la síntesisin vitro de moldes de ARNm artificiales que incubados con extractos celulares, GTP,ATP y los 20 aa en 20 tubos (cada uno con un aa marcado radioactivamente con14C) permitían obtener polipéptidos de cuya secuencia se establecieron las clavesdel código genético.Se comenzó con con ARN muy sencillos (con n codónUUUUUU.Phe-Phe-Phe.UUU PheCCCCCC.Pro-Pro-Pro.CCC ProAAAAAA.Lys-Lys-Lys.AAA LysHeteropolímeros simples(AC)nACA ThrCAC HisQue luego se fueron completando. En 1963 se descifró el código genético completo.Los codones escritos en el sentido 5 -3 . Todos los aa excepto la Met y el trip tienenmás de un codón, que normalmente se diferencian en la tercera base. Además elcodón AUG es también el codón de iniciación y hay tres codones de parada.117
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaEl codigo genético es:. Redundante: porque un aa puede ser codificado por más de un codón. No ambiguo. Pero cada codón especifica un solo aa. Universal o casi universal (salvo pequeñas variaciones en las mitocondrias, enalgunas bacterias y algunos eucariotas unicelulares) El ser humano, E.coli, lasplantas o virus. Indicando que todas las formas de vida provienen de un ancestrocomún cuyo código genético se ha preservado a lo largo de la evolución.Figura 5.El código genético.En este proceso el reconocimiento del aminoácido por su correspondiente RNAt esfundamental. Este reconocimiento se debe a una enzima la aminoacil-ARNt sintetasaque tiene dos sitios específicos, uno presenta afinidad por el aminoácido y otro por el118
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaARNt. De forma, que gracias a la especificidad de esta enzima es posible laespecificidad de un ARNt por su aminoácido.En esta fase se forma el complejo de iniciación, formado por un ribosoma unido alARNm y aun ARNt iniciador cargado. Primero se unen el ARNm y el ARNt inicadorcargado a la subunidad pequeña, luego se unirá la grande. El proceso requiere laintervención de varios factores de iniciación. La traducción siempre comienza en uncodón AUG. El crecimiento de la cadena polipeptídica en el ribosoma se produce porun proceso cíclico que se repite tantas veces como aa haya en la cadena.Intervienen tres sitios del ribosoma donde puede unirse el ARNt. El sitio P(peptidil), A(aminoacil) y E (de salida). Al comienzo cada ciclo la cadena naciente estáenganchada a un ARNt del sitio P y los lugares A y E vacios. Cuando elsegundoARNt cargado con el aa adecuado se une al sitio A. Se produce un ataque nucleófilodel grupo amino del aa-ARNt entrante que está en el sitio A, sobre el carboxilo delpeptido en crecimento del sito P con lo que se forma un enlace peptídico entre elnuevo aminoácido y el pèptido en crecimiento y el bloque del péptido en crecimientose transfiere del sito P al sitio A. Esta reacción la cataliza una actividadpeptidiltransferesa localizada en el ARNr 23s (28s en eucariotas) componente de lasubunidad grande (se trata pues de una ribozima aunque varias proteínasribosómicas parecen contribuir a que se activa). En este último paso de laelongación el ribosoma se desplaza un codón en el sentido 5 -- 3’. Con estedesplazamiento conseguimos que ARNt (ya descargado) que estaba en el sitio Ppase al sito E, mientras que el peptidil-ARNt del sito A pasa al P. El nuevo codónqueda enfrentado al sito A que ahora está vacio.119
Tema 10. Replicación, transcripción y traducciónBioquímicaFigura 6.Visión general del proceso de traducción del ARNm120
Estos datos se obtuvieron utilizando el marcaje isotópico del ADN con Titrio H3. El ADN marcado, aislado y expuesto a una emulsión photográfica durante semanas podía fotografiarse. Si el titrio se añadia durante un corto período de tiempo y la reacción se paraba observando los autoradiogramas podía observarse que el ADN marcada aparecía a ambos lados de la horquilla de replicación .
