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14Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuFigura 4. Esquema pantalla operación modo Stand alone.Fuente. Shimadzu, 2014.La figura muestra la relación entre el UV-1800 y el teclado. Losmodos y configuraciones de cada pantalla se seleccionan con losnúmeros de 0 a 9, presionar Enter o las teclas F1-F4.1.3.1 Corrección línea baseLa corrección de la línea base se realiza sin celdas en el equipo y en elrango de longitud de onda seleccionado, afecta a todas las subsecuenteslecturas con el mismo rango. La corrección de la línea base asegura unpunto de referencia antes de iniciar cualquier colección de datos, porello una vez terminada la corrección de línea base la información esalmacenada en el historial del instrumento, incluyendo analista, fechay será aplicado para todos los subsecuentes análisis.A. En la pantalla inicial con el teclado digite 2 para seleccionar elmódulo espectro (Spectrum) y Enter.

Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuB. La ventana que observará se muestra en la imagen a la derecha.Seleccione 2 para establecer el rango de longitud de onda en el quedesea analizar, ingrese 1100 con el teclado numérico y dé Enter,digite 190 y de nuevo Enter. Este corresponde al rango total deanálisis del equipo.Figura 5. Esquema pantalla operación modo Stand alone. Modulo spectrum.Fuente. Shimadzu, 2014.C. Terminada la configuración verifique que no se encuentre ningunacelda en los compartimientos. Posteriormente realice la correcciónde linea base presionando la tecla1.3.2 Preparación de la muestra en la celdade lecturaEn general todos los espectrofotómetros UV-VIS son instrumentospara la medición de muestras en solución (mezclas homogéneas),por tanto, es indispensable que si su muestra contiene partículas15

16Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzude un tamaño mayor al de una solución (colides, dispersiones,espumas), es necesario realizar un tratamiento previo como filtracióno centrifugación, ya que partículas de mayor tamaño resultan enabsorbancias altas que no corresponden a la absorción por excitaciónde la muestra, sino por obstrucción del paso de luz (cuerpos opacos).A. Asegúrese que las celdas de cuarzo estén completamente limpiasantes de adicionar su solución.B. En la primera celda adicione el solvente (blanco) dejando 1 cmabajo del borde, se recomienda realizar una adición de solventea la celda para purga, descarte y adicione nuevamente disolventeevitando que queden burbujas al interior de la solución, ya que lapresencia de aire afecta la medición.Figura 6. Macro cuvette.Fuente. https://www.brand.degC. Ubique la tapa de la celda en la parte superior de la misma. Limpiecon papel de arroz el exterior de la celda.D. Introduzca la celda con el solvente en el compartimiento superiorde referencia. Para ubicar la celda en el equipo oriente la secciónopaca de la celda hacia su frente, para permitir el correcto paso delhaz de luz a través de la celda con la solución.

Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuE. Adicione la solución a medir en la otra celda de cuarzo, repita elmismo procedimiento que para la celda de referencia. Ubique lacelda con la muestra en el compartimiento inferior del equipo,como lo muestra la imagen.Figura 7. Compartimientos para muestra UV-1800. G.Fuente. Adaptada de ry and Human Trafficking Statement Shimadzu Corp/F. Una vez ubicadas las celdas, cierre el compartimiento del equipopara realizar la medición.G. Para operar el instrumento en modo stand alone continúe en lasección 3. Si se va a operar el equipo conectado al software UVProbe continúe en la sección 5.Figura 8. Esquema pantalla menú operación stand alone.Fuente. Shimadzu, 2014.17

2.Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuOperaciones standalone en el UV-1800(Shimadzu.UV1800,2013)2.1 Lectura en modo fotométrico(photometric)A. En la pantalla en la que se encuentra oprima Return para regresaral menú inicial, con el teclado digite 1 para seleccionar el módulofotométrico (photometric) y dé Enter.El UV-1800 en modo fotométrico permite realizar una medición auna única longitud de onda (item 1), o podemos tener la posibilidadde realizar una medición hasta en 8 diferentes longitudes de onda(item 2).B. Seleccione item 1 y Enter Inmediatamente se encontrará con lavetana de la imagen.Figura 9. Esquema pantalla menú operación stand alone método fotométrico.Fuente. Shimadzu, 2014.

20Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuC. Cambie el valor de la longitud de onda con la teclaGOTOWLD. Ubique la celda con la solución de referencia (blanco) enel compartimiento superior, y la celda con el analito en elcompartimiento inferior como se describe en la sección 3.3.E. El valor que muestra el monitor corresponde a la absorbancia de sumuestra, para obtener el valor de transmitancia F1 presione yseleccione con las flechas % T.2.2 Lectura en modo espectro (spectrum)A. En la pantalla inicial con el teclado seleccione 2 para seleccionar elmódulo espectro (Spectrum) y Enter.B. La ventana que observará contiene los mismos campos que elmódulo Spectrum en el software UVProve (sección 5). Presione 1en el teclado con las flechas seleccione las unidades en las que desearealizar su medición: absorbancia 0 %, transmitancia y Enter.Figura 10. Esquema pantalla menú operación stand alone método espetro.Fuente. Shimadzu, 2014.

Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuC. Seleccione 2 para establecer el rango de longitud de onda en el quedesea analizar y Enter.D. Si desea realizar un ajuste de la escala del eje Y antes de iniciar laadquisición, puede ajustar el máximo y mínimo seleccionando laopción 3 y Enter, por ejemplo: valor mín 0.000A – 1.000A y Enter.E. Seleccione 4 y establezcla el tiempo de acumulación (tiempo deespera entre una lectura y otra) la opción Fast toma datos cada0.05s, Medium cada 0.2s, Slow cada 0.5s y Very slow cada 2.0s. Elparámetro por defecto es Medium.F. Seleccione 5 para configurar el intervalo entre una medida y otradurante el escaneo del rango de longitud de onda. Auto: configurael intervalo dependiento del rango de lectura de manera automática,0.05 toma datos cada 0.05nm y los demás valores opcionales deigual manera. Una vez seleccionado el modo de configuracióndeseado presione Enter.G. Seleccione 6 para configurar el número de scan para cada punto(de 1 a 99 veces).H Seleccione 7 y configure la forma en la cual desea visualizar elespectro. Sequential: en la pantalla solo será visualizado el espectroen adquisición y por cada adquisición se actualiza. Overlay: lapantalla no se actualiza, comenzará a ver el espectro en adquisicióndesde la izquierda sobre los adquiridos anteriormente.Actualmente la opción 8 siempre permanecerá en off, ya que no seencuentra conectado el accesorio de impresión.I. Ubique las celdas de referencia y la muestra con el analito en loscompartimientos superior e inferior, como se describe en la sección4.3, cierre la tapa del equipo para iniciar la adquisición de datos,presione la tecla STARTSTOP21

22Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuj. Una vez termine la adquisición obtendrá una pantalla como seevidencia en la imagen. Si la escala no le permite ver la totalidaddel espectro presione Return para ajustar el zoom y seleccioneAutoScal con la tecla F3.Figura 11. Esquema pantalla resultado adquisición espectro en modo stand alone.Fuente. Shimadzu, 2014.k. Si desea ubicarse en una coodenada del espectro movilice la líneade lectura con las flechas hacia la derecha y hacia la izquierda. Lascoordenadas Abs y longitud de onda le aparecerán resaltadas en laparte inferior del espectro. Almacene los datos de la adquisición ensu memoria USB, que puede conectar presionando F3 (LoadCurv).Figura 12. Imagen externa UV-1800.Fuente. LabCommerce, 2017

3.Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuOperación del UV-1800con el software UVProbe (Shimadzu.UV-Priobe, 2013)El software disponible para el funcionamiento del equipo UV1800 Shimadzu es el UVProve, un software propietario de la casafabricante Shimadzu. Permite colectar, analizar y generar reportes demanera simple e intuitiva.El software incluye cuatro componentes básicos:w El módulo Spectrum, usado para escanear y analizar analitos en unrango determinado de longitudes de onda.w El módulo Kinetics, usado para realizar mediciones en diferentesintervalos de tiempo; es un método útil en la determinacion decinéticas de reaccion Michaelis-Menten, en las que se describe lavelocidad de reacción por catálisis enzimática.w El módulo photometric para análisis cuantitativo de analitos. Coneste paquete es posible realizar la medición de un único valor deabsorbancia (o % T) a una o más (hasta 8) longitudes de ondaespecificadas por el usuario, así como la construcción de curvas decalibración para el análisis cuantitativo de un analito basado en laley de Lambert-bee.w Generador de reportes.3.1 Procedimiento para la operación delUV-1800 con el software UV-PROVEA. Para iniciar la conexión el UV-Probe al PC verifique la conexiónUSB del UV-1800 al equipo de cómputo desde el cual operará elequipo, el cual deberá tener instalado y configurado el softwareUVProbe. Inicie el software, como se muestra a continuación:

24Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuFigura 13. Imagen ventana inicial software UVProbe.A ícono en el escritorio para iniciarUVProbe.BPantalla inicial de UVProbe,en la barra de herramientas de laparte inferior encontrará el íconopara solicitar la conexión al equipodesde el software una vez se hallaencendido el UV-1800.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.B. Verifique que el espectrofotómetro se encuentre conectado a su PCen la barra de herramientas inferior. Si está conectado los botoneslos observará activos y el último ícono de la derecha será Disconnect(imagen arriba). En caso contrario, haga clic en Connect en labarra de herramientas inferior.3.2 Módulo SpectrumEl objeto del módulo Spectrum es el control del espectrofotómetropara la adquisición de un barrido en un rango de longitudes de ondade la muestra de análisis.El módulo incluye 3 paneles y una barra de herramientas (imagena la derecha):En el panel de operación visualiza la información colectada, lasfunciones de manipulación como Data Print, áreas de los picos ypicos seleccionados. En el panel de método visualiza la informacióndel método de colección de datos actual. En el panel de gráfico sevisualizan los gráficos activos, superpuestos con anteriores scan olistados uno tras otro.

Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuFigura 14. Imagen ventana inicial software UVProbe para operaciónen modo espectro.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.El procedimiento general para la construcción de un espectro enun rango de longitud determinada se muestra a continuación:Figura 15. Diagrama procedimiento para adquisición en modoespectro usando UVprobe.Crear nuevo método de colección de datos(Parámetros)Guardar método demedidaCorrección línea basePreparación de la muestra en la celdaColección de datos del espectroGuardar datosFuente. Elaboración propia.25

26Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzu3.2.1 Creación nuevo método de colección de datosA. Para iniciar el módulo Spectrum ubicado en la barra de herramientassuperior, dé clic en el íconoB. De la barra de herramientas superior, seleccione Edit Method, ohaga clic en el ícono Método para desplegar el siguiente cuadro dediálogo:Figura 16. Barra de herramientas principal UVprobe en modo espectro.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.C. En la pestaña Measurement, configure el rango de longitud deonda en el que desea analizar su muestra, en la opción Wavelengthrange (nm) por ejemplo si su rango de interés es: (600nm y 450nm)ingrese 600 en el campo Start y 450 en el campo End.D. Seleccione en el campo velocidad de barrido (Scan Speed) mediopara una adquisición cada 1nm; si desea mayor resolucióndisminuya la velocidad de scan hasta 0.1nm.E. En el campo de Scan Mode seleccione single para realizar una únicalectura por punto en el rango de longitud de onda seleccionado.

Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuFigura 17. Menú configuración parámetros de medición modo espectro.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.F. En la pestaña Instrument Parameter de la misma ventana (imagena la izquierda), seleccione Absorbancia en la lista de formas demedida (Measuring Mode).G. Clic en OK para enviar los parámetros al espectrómetro. Cercióresede la configuración en el espectrofotómetro.Figura 18. Menú configuración parámetros del instrumento modo espectro.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.27

28Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzu3.2.2 Guardar método de medidaGuarde el método como un archivo .smd para ello:Figura 19. Barra de herramientas principal uv probe parámetrosde medición modo.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.A. Seleccione de la barra de herramientas superior File Save as.B. En el campo File name, ingrese el nombre del archivo, por ejemplo:Metodo Espectro 600-450.C. En la lista Save as type, dé clic en Method file (*.smd), acto seguidoclic en Save.3.2.3 Corrección línea baseLa corrección de la línea base se realiza sin celdas en el equipo, y en elrango de longitud de onda seleccionado afecta a todas las subsecuenteslecturas con el mismo rango. Si la corrección de línea base se realizócon el equipo operando en modo Stand Alone (Sección 4.2) no esnecesario realizarla nuevamente usando el software. Si no ha realizadola corrección puede hacerla usando UV-Probe, como se indica acontinuación:A. Seleccione Window Spectrum para abrir el módulo Spectrum.B. Clic sobre Connect en la barra de herramientas inferior paraconectar el software al UV-1800.C. Cuando los parámetros de la línea base aparezcan en el panel demétodo entre 700 como Start y 300 como End, modifíquelos deacuerdo al rango de longitud de onda de su interés. Dé clic en OK.Verifique la lectura en la ventana del espectrofotómetro.

Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuD. Cuando el scan ha finalizado, dé clic en la pestaña InstrumentHistory y verifique que la corrección de línea base haya sidoefectuada.Figura 20. Ventana UVProbe de procesos.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.3.2.4 Colección de datos para el espectroA. Para asegurar que toda la información colectada es visualizada enel gráfico, dé clic derecho con el mouse y seleccione Auto Scale.Figura 21. Menú configuración de escala UVProbe para modo espectro.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.B. Dé clic en Start en la barra inferior. En el cuadro emergente NewData Set indique el nombre del espectro PE: Didymiun en el campoFile y el nombre de la información de salida PE: Data 1, y dé clicen OK para iniciar la medición.29

30Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzuFigura 22. Ventana UVProbe almacenar método.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.3.2.5 Almacenamiento de la informaciónPara este punto del análisis la información ha sido colectada ynombrada, la información ha sido almacenada únicamente en lamemoria; pero no ha sido almacenada en el disco. Si el software escerrado en este momento la información se perderá. Para preservarla información es necesario guardar cada información en un archivoque incluirá: tabla de Peak Area, tabla de Point Pick, tabla de PeakPick, información del método, resumen de la información e historialde la información.A. Seleccione File Save as.B. Seleccione la ruta apropiada para el directorio en el campo superiorde la ventana de diálogo.C. Ingrese el nombre del archivo, por ejemplo: Diymium.D. Seleccione .spc in la lista Save as type.E. Clic en Save.Para editar reportes y manipulación del espectro diríjase a la sección5.3: generación de reportes.

Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetroUV-VIS UV-1800 de shimadzu3.3 Módulo photometricEl objetivo básico del módulo fotométrico es determinar laconcentración de un analito en una muestra. Al realizar medidas deabsorbancia (o transmitancia) de soluciones estándar de diferenteconcentración con el espectrofotómetro el software nos sirve deherramienta para la creación de una curva de calibración, la cual puedeser usada para calcular la concentración de muestras desconocidas,interpolando la relación matemática calculada.El módulo incluye cuatro paneles importantes: tabla de estándares,curva de estándares, tabla de muestras, gráfica de muestras, cada paneltiene solamente una función a visualizar, con excepción de la tabla demuestras que incluye los estándares.Figura 23. Esquema de ventanas UVProbe para método cuantitativo.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.Para ingresar al módulo photometricla barra de herramientas superior:seleccione el ícono deFigura 24. Barra de herramientas UBProbe principal para modo fotométrico.Fuente. Shimadzu U.-P. , 2014.31

El procedimie

Aplicaciones y generalidades de un espectrofotómetro UV-VIS UV-1800 de shimadzu 1.1 Especificaciones generales del Instrumento Las principales partes de un espectrofotómetro son tres, el sistema de iluminación, el sistema monocromador y el sistema de detección y registro. Tabla 1. Especificaciones generales del instrumento.