WIXLIB

B.M errifi el d153al s o b e bl o c k e d, u s u all y wit h b e n z yl- b a s e d d eri v ati v e s. T h e s y nt h e si s d e p e n d so n t h e diff er e nti al s e n siti vit y of t h e s e t w o cl a s s e s of pr ot e cti n g gr o u p s t o a ci d,w hi c h i s gr e at er t h a n 1 0 0 0: 1. T h e B o c gr o u p i s c o m pl et el y r e m o v e d wit h 5 0 %trifl u or o a c eti c a ci d i n di c hl or o m et h a n e, wit h mi ni m al l o s s of t h e a n c h ori n gb o n d or of t h e ot h er pr ot e cti n g gr o u p s. T h e r e s ulti n g α a mi n e s alt i s n e utr ali z e d wit h a t e rti a r y a mi n e s u c h a s dii s o p r o p yl et h yl a mi n e a n d t h e f r e e a mi n e oft h e r e si n- b o u n d a mi n o a ci d i s t h e n r e a d y t o c o u pl e wit h a s e c o n d B o c- a mi n oa ci d. T h e l att er m u st b e a cti v at e d f or t h e r e a cti o n t o o c c ur. T h e si m pl e st a n dm o st oft e n u s e d pr o c e d ur e i s a cti v ati o n wit h di c y cl o h e x yl c ar b o dii mi d e ( 1 0) a ss h o w n, b ut a cti v e e st e r s ( 1 1), a n h y d ri d e s ( 1 2), a n d m a n y ot h e r a cti v at e dd eri v ati v e s h a v e b e e n s u c c e s sf ull y a p pli e d. All of t h e s e r e a cti o n s ar e c arri e d o utu n d er n o n- a q u e o u s c o n diti o n s i n or g a ni c s ol v e nt s t h at s w ell t h e r e si n a n da c c el e r at e t h e r at e s. Di c hl o r o m et h a n e a n d di m et h ylf or m a mi d e ar e t h e s ol v e nt sof c h oi c e.T o e xt e n d t h e p e pti d e c h ai n t h e d e pr ot e cti o n, n e utr ali z ati o n a n d c o u pli n gst e p s ar e r e p e at e d f or e a c h of t h e s u c c e e di n g a mi n o a ci d s u ntil t h e d e sir e ds e q u e n c e h a s b e e n a s s e m bl e d. Fi n all y, t h e c o m pl et e d p e pti d e i s d e pr ot e ct e da n d cl e a v e d fr o m t h e s oli d s u p p ort. Wit h t h e c h e mi str y d e s cri b e d h er e, t hi s i sa c c o m pli s h e d b y tr e at m e nt wit h a str o n g a n h y dr o u s a ci d s u c h a s H F ( 1 3). T h efr e e p e pti d e i s t h e n p urifi e d b y s uit a bl e pr o c e d ur e s.It i s v er y i m p ort a nt t h at t h e r e p etiti v e st e p s pr o c e e d r a pi dl y, i n hi g h yi el d s,a n d wit h mi ni m al si d e r e a cti o n s i n o r d e r t o p r e v e nt t h e a c c u m ul ati o n ofe x c e s si v e a m o u nt s of b y- pr o d u ct s. M u c h of o ur eff ort h a s b e e n dir e ct e d t o w ar dd e v el o pi n g a n d e v al u ati n g t h e s e r e q ui r e m e nt s.S O LI D P H A S E N U C L E O TI D E S Y N T H E SI SSi mil ar s c h e m e s f or t h e s oli d p h a s e s y nt h e si s of oli g o n u cl e oti d e s h a v e n o w b e e nd e v el o p e d w hi c h a r e r a pi d a n d gi v e r el ati v el y hi g h yi el d s ( 1 4, 1 5). T h e ye m pl o y pr ot e ct e d n u cl e oti d e s a s m o n o m er u nit s a n d m a k e u s e of eit h er p h o sp h otri e st er or p h o s p hit e tri e st er c h e mi str y. O n e s u c h pr o c e d ur e i s o utli n e d i nFi g u r e 4. T h e r e si n i s fi r st f u n cti o n ali z e d wit h a n a mi n o m et h yl gr o u p a n d t h en u cl e oti d e d eri v ati v e i s c o u pl e d t o it, t hr o u g h a s p a c er, b y a st a bl e a mi d e b o n d.I n t hi s e x a m pl e t h e 5’ h y d r o x yl i s e st e rifi e d t o t h e s p a c er a n d t h e 3’ h y dr o x yl i st e m p or aril y bl o c k e d wit h a di m et h o x ytrit yl ( D M T) gr o u p. T h e l att er i s r em o v e d wit h a ci d o r Z n B r 2 a n d t h e c h ai n i s e xt e n d e d at t h e 3’ e n d b y c o u pli n gwit h t h e n e xt pr ot e ct e d n u cl e oti d e b y a cti v ati o n wit h 1-( m e sit yl e n e- 2- s ulf o n yl)3- nit r o- 1, 2, 4-t ri a z oli d e ( M S N T). T h e c o m pl et e d oli g o n u cl e oti d e i s fi n all ycl e a v e d fr o m t h e s oli d s u p p ort a n d d e pr ot e ct e d b y tr e at m e nt wit h a b a s e s u c ha s N H 4 O H or t etr a m et h yl g u a ni di n e a n d t h e n wit h h ot a c eti c a ci d. T h e pr od u ct s ar e r e a dil y p urifi e d b y i o n e x c h a n g e c hr o m at o gr a p h y or b y el e ctr o p h or esi s w h e r e t h e d e si r e d p r o d u ct al w a y s h a s t h e gr e at e st n e g ati v e c h ar g e. I will n otd e al f urt h er wit h p ol y n u cl e oti d e s a n d t h eir u s e i n sit e dir e ct e d m ut a g e n e si s orwit h s y nt h eti c g e n e s i n t hi s pr e s e nt ati o n b ut will c o n c e ntr at e i n st e a d o n p e pti d e s a n d pr ot ei n s.

154Fi g. 4.C h e mi str y 1 9 8 4A s c h e m e f or s oli d p h a s e n u cl e oti d e s y nt h e si s.T H E S U P P O R TT h e fi r st r e q ui r e m e nt f o r t h e d e v el o p m e nt of s oli d p h a s e s y nt h e si s w a s as uit a bl e s u p p ort. Aft er e x a mi n ati o n of m a n y p ot e nti al s u p p ort s it w a s f o u n dt h at t h e m o st s ati sf a ct or y o n e w a s a g el pr e p ar e d b y s u s p e n si o n c o p ol y m eri z ati o n of st y r e n e a n d 1 % of di vi n yl b e n z e n e a s c r o s sli n ki n g a g e nt ( 4). T h er e s ulti n g s p h eri c al b e a d s ( Fi g. 5) ar e a b o ut 5 0 µ m i n di a m et er w h e n dr y, b ut i no r g a ni c s ol v e nt s s u c h a s di c hl o r o m et h a n e t h e y s w ell t o 5 o r 6 ti m e s t h ei rori gi n al v ol u m e. F urt h er m or e, a s p e pti d e c h ai n s gr o w t h e dr y v ol u m e i n cr e a s e st o a c c o m o d at e t h e a d d e d m a s s a n d, m o st i m p ort a ntl y, t h e s w oll e n v ol u m e

B.M errifi el d155Fi g. 5. C o p ol y(st yr e n e- 1 %- di vi n yl b e n z e n e) r esi n.c o nti n u e s t o i n cr e a s e. V al u e s u p t o 2 5 f ol d h a v e b e e n m e a s ur e d a n d c al c ul ati o n s i n di c at e t h at t h e m a xi m u m e x p a n si o n s h o ul d b e a b o ut 2 0 0 f ol d ( 1 6). T hi sm e a n s t h at t h e p ol y st y r e n e m at ri x a n d t h e p e n d a nt p e pti d e a r e hi g hl y s ol v at e dd uri n g t h e c h e mi c al r e a cti o n s a n d ar e fr e el y a c c e s si bl e t o diff u si n g r e a g e nt s.T h e r e a cti o n s o c c ur n ot o nl y at t h e s urf a c e of t h e b e a d b ut, i n m aj or p art,wit hi n t h e i nt eri or of t h e cr o s sli n k e d p ol y m eri c m atri x. T hi s c o ul d b e d e m o nstr at e d b y a ut or a di o gr a p h y of a cr o s s s e cti o n of a b e a d c o nt ai ni n g a s y nt h eti ctriti u m-l a b el e d p e pti d e ( 1 7). At t hi s r e s ol uti o n t h e sil v er gr ai n s w er e l o c at e du nif or ml y t hr o u g h o ut t h e b e a d, alt h o u g h t h e di stri b uti o n i s n ot k n o w n at t h em ol e c ul ar l e v el. B e c a u s e of t h e s ol v ati o n a n d s w elli n g of t h e b e a d s, t h e r e a c-

156C h e mi str y 1 9 8 4ti o n s ar e v er y f a st, wit h h alf ti m e s i n t h e or d er of s e c o n d s f or b ot h t h e c o u pli n ga n d t h e d e p r ot e cti o n st e p s. C u r r e nt eff o rt s t o e v al u at e t h e eff e ct s of m a s str a n sf er a n d diff u si o n i n di c at e t h at t h e y ar e n ot r at e li miti n g. W e b eli e v e t h es oli d m atri x n ot o nl y d o e s n ot h a v e d etri m e nt al eff e ct s o n t h e s y nt h e si s b uta ct u all y h a s b e n efi ci al eff e ct s i n c ert ai n i n st a n c e s. O n e of t h e w ell r e c o g ni z e ddiffi c ulti e s wit h t h e cl a s si c al s y nt h e si s i n h o m o g e n e o u s s ol uti o n i s i n s ol u bilit yof s o m e i nt er m e di at e s. T hi s pr o bl e m c a n b e o v er c o m e i n m a n y c a s e s b y t h e u s eof s oli d s u p p ort s, w h er e t h e p e pti d e c h ai n a n d t h e li g htl y cr o s sli n k e d p ol y m erc h ai n b e c o m e i nti m at el y mi x e d a n d e x ert a m ut u al s ol v ati n g eff e ct o n o n ea n ot h er. It b e c o m e s t h er m o d y n a mi c all y l e s s f a v or a bl e f or t h e p e pti d e t o s elfa g gr e g at e a n d it r e m ai n s a v ail a bl e f or r e a cti o n. F or t hi s t o o c c ur t h e s ol v at e dst at e of t h e b o u n d p e pti d e n e e d s o nl y t o b e f a v or a bl e r el ati v e t o t h e a m or p h o u su n s ol v at e d st at e wit hi n t h e p e pti d e- r e si n m at ri x ( 1 6). Si mil a r s ol u bili zi n gpr o p erti e s of li n e ar p ol y m er s f or c o v al e ntl y att a c h e d c o m p o n e nt s ar e k n o w n,b ut t h e eff e ct will b e gr e at er f or a li g htl y cr o s s-li n k e d p ol y m er n et w or k. T h ep h e n o m e n o n c a n b e ill u str at e d b y t h e s y nt h e si s of oli g oi s ol e u ci n e s ( 1 8). T h est a n d ar d s ol uti o n s y nt h e si s f ail e d aft er t h e t etr a p e pti d e st a g e b e c a u s e of a g gr eg ati o n a n d i n s ol u bilit y, w h er e a s t h e c h ai n c o ul d b e e xt e n d e d u p t o 8 r e si d u e so n li n e a r p ol y et h yl e n e gl y c ol. A s oli d p h a s e s y nt h e si s pr o c e e d e d s m o ot hl y atl e a st a s f a r a s t h e d o d e c a m e r, w h e r e t h e e x p e ri m e nt w a s st o p p e d. T h er e i s v er ysi g nifi c a nt p ol y m e r c h ai n m oti o n i n t h e s e c r o s sli n k e d p ol y st yr e n e r e si n s. B ot h1H a n d 1 3 C N M R m e a s ur e m e nt s ( 1 9) h a v e s h o w n t h at t h e m oti o n al r at e s f ort h e ar o m ati c gr o u p s a n d t h e ali p h ati c b a c k b o n e at o m s i n C H 2 CI 2 a r e hi g h a n de q ui v al e nt t o li n e a r s ol u bl e p ol y st y r e n eT h e α c a r b o n 13Cr e s o n a n c e s of m o d el r e si n- s u p p ort e d p e pti d e s w er e a s s h ar p a s t h e s ol v e nt p e a ki n C H2 Cl 2 o r di m et h ylf o r m a mi d e a n d si mil a r t o s m all m ol e c ul e s i n s ol uti o ns e c). A v ari et y of c h e mi c al e x p eri m e nt s al s o h a v e s h o w n p ol y m erfl e xi bilit y. F or e x a m pl e s h ort r e si n- b o u n d p e pti d e s t h at w er e t o o f ar a p art o na v er a g e t o r e a c h o n e a n ot h er if t h e r e si n w er e ri gi d c o ul d b e s h o w n t o r e a ct t ot h e e xt e nt of 9 9. 5 % i n di c ati n g c o n si d e r a bl e m oti o n of t h e p ol y st y r e n e s e gm e nt s wit hi n t h e m atri x ( 2 0).M a n y ot h e r s oli d s u p p o rt s h a v e al s o b e e n e x a mi n e d a n d s e v er al h a v e b e e ns ati sf a ct or y f or p e pti d e s y nt h e si s. T h e s e h a v e i n cl u d e d p ol y m et h yl m et h a cr yl at e, p ol y s a c c h a ri d e s, p h e n oli c r e si n s, sili c a, p o r o u s gl a s s, a n d p ol y a c r yl ami d e s, b ut o nl y t h e l att er h a v e s e e n wi d e s pr e a d u s e ( 2 1). C o m p ar ati v e st u di e swit h p ol y st y r e n e a n d p ol y a c r yl a mi d e h a v e s h o w n t h at t h e y c a n b e e q u all yeff e cti v e, e v e n wit h diffi c ult p e pti d e s.A U T O M A TI O NT h e a bilit y t o p urif y aft er e a c h r e a cti o n b y si m pl e filtr ati o n a n d w a s hi n g a n dt h e f a ct t h at all r e a cti o n s c o ul d b e c o n d u ct e d wit hi n a si n gl e r e a cti o n v e s s ela p p e a r e d t o l e n d t h e m s el v e s i d e all y t o a m e c h a ni z e d a n d a ut o m at e d pr o c e s s.I niti all y, a si m pl e m a n u all y o p er at e d a p p ar at u s w a s c o n str u ct e d ( Fi g. 6). T hi ss y st e m w a s fir st u s e d t o w or k o ut t h e m et h o d ol o g y a n d t o s y nt h e si z e br a d yki ni n ( 2 2) a n gi ot e n si n ( 2 3) o x yt o ci n ( 2 4), a n d m a n y ot h er s m all p e pti d e s. I nor d er t o a c c el er at e t h e pr o c e s s w e u n d ert o o k t h e d e si g n a n d c o n str u cti o n ( 2 5)

B.Fi g. 6.AM errifi el d157m a n u all y o p er at e d s y nt h e si s a p p ar at u sof t h e a ut o m at e d i n str u m e nt s h o w n i n Fi g. 7. T h e e s s e nti al f e at ur e s w er e t h er e a cti o n v e s s el, c o nt ai ni n g t h e r e si n wit h it s gr o wi n g p e pti d e c h ai n, a n d t h en e c e s s a r y pl u m bi n g t o e n a bl e t h e a p p r o p ri at e s ol v e nt s a n d r e a g e nt s t o b ep u m p e d i n, mi x e d, a n d r e m o v e d i n t h e pr o p er s e q u e n c e. T h e s e m e c h a ni c ale v e nt s w er e u n d er t h e c o ntr ol of a si m pl e st e p pi n g dr u m pr o gr a m m er a n d a s etof ti m e r s. I n t h e p a st f e w y e a r s m a n y c o m m e r ci al i n st r u m e nt s h a v e b e e nc o n str u ct e d i n s e v er al c o u ntri e s. T h e y diff er c o n si d er a bl y i n d et ail, p arti c ul arl yi n t h e s o p hi sti c ati o n of t h e el e ctr o ni c pr o gr a m m e c h a ni s m s b ut ar e d e si g n e d t oc arr y o ut t h e s a m e c h e mi str y.T H E S Y N T H E SI S O F RI B O N U C L E A S E AT h e i d e a of c h e mi c all y s y nt h e si zi n g a n e n z y m e m u st h a v e o c c urr e d t o m a n yp e o pl e o v er t h e y e ar s. T h er e w a s a ti m e w h e n s u c h a t h o u g ht w o ul d h a v e b e e nu n a c c e pt a bl e e v e n o n p hil o s o p hi c al gr o u n d s, b ut fr o m t h e p eri o d w h e n e nz y m e s w er e s h o w n t o b e pr ot ei n s a n d pr ot ei n s w er e s h o w n t o b e di s cr et eor g a ni c m ol e c ul e s it w a s a g o al t h at c h e mi st s c o ul d b e gi n t o t hi n k a b o ut. If a ne n z y m e c o ul d b e m a d e i n t h e l a b or at or y, t h e n it s h o ul d b e c o m e p o s si bl e t ol e ar n n e w t hi n g s a b o ut h o w t h e s e l ar g e a n d v er y c o m pl e x m ol e c ul e s f u n cti o n.S p e cifi c c h a n g e s c o ul d b e m a d e i n t h eir str u ct ur e s t h at c o ul d n ot b e m a d er e a dil y b y alt e ri n g t h e n ati v e p r ot ei n a n d d at a s h o ul d b e f ort h c o mi n g t h atw o ul d s u p pl e m e nt t h e i nf or m ati o n alr e a d y o bt ai n e d fr o m t h e n at ur al e n z y m e st h e m s el v e s. I n t hi s r e g ar d, a q u ot ati o n fr o m Fi s c h er i n 1 9 0 6 ( 2 6) i s p erti n e nt:“ W h er e a s c a uti o u s pr of e s si o n al c oll e a g u e s f e ar t h at a r ati o n al st u d y of t hi scl a s s of c o m p o u n d s [ pr ot ei n s], b e c a u s e of t h eir c o m pli c at e d str u ct ur e a n d t h eir

C h e mi str y 1 9 8 4158Fi g. 7.A n a ut o m at e d p e pti d e s y nt h e si z er.hi g hl y i n c o n v e ni e nt p h y si c al c h ar a ct eri sti c s, w o ul d t o d a y still u n c o v er i n s urm o u nt a bl e diffi c ulti e s, ot h er o pti mi sti c all y e n d o w e d o b s er v er s, a m o n g w hi c h Iwill c o u nt m y s elf, ar e i n cli n e d t o t h e vi e w t h at a n att e m pt s h o ul d at l e a st b em a d e t o b e si e g e t hi s vir gi n f ortr e s s wit h all t h e e x p e di e nt s of t h e pr e s e nt;b e c a u s e o nl y t hr o u g h t hi s h a z ar d o u s aff air c a n t h e li mit ati o n s of t h e a bilit y ofo ur m et h o d s b e a s c ert ai n e d. ”

B.M errifi el d159Wit h t h e d e v el o p m e nt of s oli d p h a s e p e pti d e s y nt h e si s a n d it s a ut o m ati o nt h e ti m e s e e m e d ri g ht t o att e m pt t h e t ot al s y nt h e si s of a n e n z y m e. Dr. B er n dG utt e a n d I s el e ct e d b o vi n e p a n cr e ati c ri b o n u cl e a s e A b e c a u s e it w a s a s m allst a bl e pr ot ei n of k n o w n a mi n o a ci d s e q u e n c e ( 2 7), a n d t h e t hr e e di m e n si o n alstr u ct ur e w a s k n o w n fr o m X-r a y diffr a cti o n st u di e s ( 2 8). M u c h of t h e d et ail e dm e c h a ni s m b y w hi c h t hi s e n z y m e h y d r ol y z e s a n d d e p ol y m eri z e s ri b o n u cl ei ca ci d w a s al s o k n o w n. T h e p ur p o s e of a c h e mi c al s y nt h e si s of t hi s 1 2 4-r e si d u em ol e c ul e w a s, fir st, si m pl y t o d e m o n str at e t h at a pr ot ei n wit h t h e hi g h c at al yti ca cti vit y a n d s p e cifi cit y of a n at ur all y o c c urri n g e n z y m e c o ul d b e s y nt h e si z e d i nt h e l a b or at or y. F or t h e l o n g r a n g e t h e m or e i m p ort a nt p ur p o s e w a s t o pr o vi d e an e w a p pr o a c h t o t h e st u d y of e n z y m e s. W e b eli e v e d it s h o ul d b e p o s si bl e t om o dif y t h e str u ct ur e a n d t o alt er t h e a cti vit y a n d t h e s u b str at e s p e cifi cit y of t h ee n z y m e.T h e s y nt h e si s ( 2 9) w a s c arri e d o ut o n a c o p ol y( st yr e n e- 1 %- di vi n yl b e n z e n e)r e si n s u p p ort u si n g t h e g e n er al m et h o d s d e s cri b e d a b o v e. T h e C-t er mi n al B o cV al w a s a n c h or e d t o t h e s oli d m atri x b y a b e n z yl e st er b o n d, t h e u s u al b e n z ylb a s e d si d e c h ai n pr ot e cti n g gr o u p s w er e u s e d a n d t h e B o c gr o u p pr o vi d e d t h er e v er si bl epr ot e cti o n. T h e d e pr ot e cti o n st e p s w er e wit h trifl u or o a c eti c a ci da n d t h e c o u pli n g r e a cti o n s w er e wit h di c y cl o h e x yl c ar b o dii mi d e a cti v ati o n. Fi g.8 s h o w s t h e fi n al pr ot e ct e d d eri v ati v e of ri b o n u cl e a s e. It c o nt ai n e d a t ot al of 6 7si d e c h ai n p r ot e cti n g g r o u p s a n d h a d a m ol e c ul a r w ei g ht of 1 9, 7 9 1. T h es y nt h e si s i s s u m m a ri z e d i n T a bl e I. T h e o v er all yi el d aft er s e v er al p urifi c ati o npr o c e d ur e s w a s a b o ut 3 % b a s e d o n t h e ori gi n al a m o u nt of v ali n e att a c h e d t ot h e r e si n. T h e r e w a s a l a r g e ( 8 3 %) 1 o s s of c h ai n s d uri n g t h e a s s e m bl y of t h ep e pti d e c h ai n d u e t o p arti al i n st a bilit y of t h e a n c h ori n g b o n d, a n d t h e a c c u m ul at e d l o s s e s d uri n g H F cl e a v a g e fr o m t h e r e si n a n d t h e p urifi c ati o n st e p s w er ea n ot h er 8 0 %. T h e cr u d e cl e a v e d pr o d u ct w a s air o xi di z e d t o f or m t h e f o urdi s ulli d e b o n d s a n d t h e m o n o m er fr a cti o n w a s i s ol at e d b y g el filtr ati o n. T h em o n o m er s wit h i n c orr e ct di s ulli d e p airi n g or i n c orr e ct f ol di n g w er e di g e st e d b yt r y p si n a n d t h e s m all f r a g m e nt s w e r e s e p a r at e d fr o m t h e st a bl e pr ot ei n wit h t h ec orr e ct str u ct ur e. A n a m m o ni u m s ulf at e fr a cti o n ati o n g a v e t h e fi n al p urifi e de n z y m e p o s s e s si n g a p pr o xi m at el y 8 0 % s p e cifi c a cti vit y c o m p ar e d wit h n ati v eri b o n u cl e a s e A. W e c o ul d n ot cl ai m t h at o ur pr o d u ct w a s c o m pl et el y p ur e ort h at t h e s y nt h e si s c o n stit ut e d a st r u ct u r e p r o of f o r R N a s e, o nl y t h at t h em ol e c ul e s h o w e d a cl o s e c h e mi c al a n d p h y si c al r e s e m bl a n c e t o t h e n ati v ep r ot ei n a n d t h at it w a s a t r u e e n z y m e. T h e c h e mi c al a n d p h y si c al c o m p ari s o n sw e r e b a s e d o n a mi n o a ci d a n al y si s, e n z y m e di g e sti o n s, p e pti d e m a p s, p a p erel e ct r o p h o r e si s, g el filt r ati o n, i o n- e x c h a n g e c h r o m at o g r a p h y, a n d a nti b o d yn e utr ali z ati o n. At t h at ti m e w e di d n ot h a v e H P L C or a n affi nit y c hr o m at og r a p h y s y st e m.T a bl e II s u m m ari z e s t h e a cti vit y d at a at v ari o u s st a g e s of p urifi c ati o n of t h es y nt h eti c e n z y m e. B ot h t h e s p e cifi c a cti vit y a n d t h e t ot al n u m b er of u nit s ofR N a s e i n cr e a s e d a s t h e p urifi c ati o n pr o c e e d e d, i n di c ati n g eit h er t h at i n hi bit or yi m p uriti e s w er e b ei n g r e m o v e d or t h at t h e m ol e c ul e w a s gr a d u all y r ef ol di n gi nt o a c o nf o r m ati o n t h at m o r e cl o s el y r e s e m bl e d t h e n ati v e st r u ct u r e. T h es u b str at e s p e cifi cit y of t h e s y nt h eti c e n z y m e w a s c o n si st e nt wit h t h at t o b e

B.161M errifi el d1001712T a bl e II3736.42564.41692.9

162C h e mi str y 1 9 8 4e x p e ct e d f or R N a s e A: it w a s a bl e t o cl e a v e b ot h l ar g e ( R N A) a n d s m all ( C p)s u b str at e s a n d t h er ef or e t o c at al y z e b ot h t h e tr a n s p h o s p h or yl ati o n a n d t h eh y dr ol y si s st e p s; it w a s s p e cifi c f or D-ri b o s e i n st e a d of D- d e o x yri b o s e a n d f or ap yri mi di n e i n st e a d of a p uri n e at t h e 3’ p o siti o n of t h e p h o s p h o di e st er s u b str at e( T a bl e III). T h e K m v al u e s t o w ar d R N A w er e al s o t h e s a m e f or t h e n at ur ala n d s y nt h eti c e n z y m e s.T h e p urifi e d R N a s e A w a s c o m p ar e d o n a C M- c ell ul o s e c ol u m n wit h n at ur alR N a s e A a n d wit h r e d u c e d a n d r e o xi di z e d n at u r al R N a s e A. T h e y w e r ei d e nti c al b y t hi s crit eri o n, w hi c h w a s t h e o n e fir st u s e d b y W hit e ( 3 0) t o s h o wt h at R N a s e A aft e r r e d u cti o n a n d r e o xi d ati o n of t h e di s ulfi d e b o n d s w a si n di sti n g ui s h a bl e f r o m t h e n ati v e e n z y m e. Hi

The general sche me for solid phase synthesis. B. M errifi el d 151 Fi g. 2. M o n o mer u nits f or s oli d p hase s y nt hesis wit h a n i ns ol u ble particle, i n dicate d b y t he lar ge circles, w hic h is f u ncti o nalize d wit h a gr o u p, X. T he first m o n o mer u nit, s mall circles, is bl oc ke d at o ne e n d .