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의학석사 학위논문유전성 유방암·난소암에서BRCA1/BRCA2 돌연변이 검출을 위한차세대 염기서열 분석법의 임상 적용2016년 2월서울대학교 대학원의학과 검사의학 전공이 승 준
국문초록서론: 국내 통계에 따르면 유방암 및 난소암은 여성에서 발생하는암 중 각각 2번째, 10번째로 흔한 암이다. BRCA1 및 BRCA2유전자의 돌연변이는 유전성 유방암 및 난소암의 발병위험도를 5배이상 높이는 것으로 알려져 있다. 상기 유전자들은 각각 5.6 Kb,10.3 Kb의 크기를 가지고 있으며, 대립유전자의 이질성을 보일뿐만 아니라 돌연변이 호발 부위도 없다. 이러한 이유로 BRCA1 및BRCA2 유전자는 검사 및 해석이 용이하지 않다. 본 연구에서는전통적인 검사법인 Sanger sequencing 및 multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA)을 대체할 수 있는 방법인next-generation sequencing (NGS)을 이용한 유전자 패널의임상적 적용 가능성을 검토하고자 RCA2Sanger유전자에서돌연변이가 확인된 50명의 환자 (9명의 엑손 결손 및 41명의점돌연변이)를 분석대상으로 하였다. 평가대상인 유전자 패널 3종은TruSeq Custom Amplicon, BRCA Tumor MASTR Plus 및 IonAmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel이었으며, MiSeq 및 Iontorrent PGM을 이용하여 염기서열 분석을 시행하였다.결과: 염기서열 분석에 있어 Sanger sequencing와 비교했을 때TruSeq Custom Amplicon은 100%, BRCA Tumor MASTRi
Plus는 99.6%, Ion AmpliSeq BRCA panel은 99.2%의 민감도를보였다. 위양성 결과는 BRCA Tumor MASTR Plus에서만 133건보고되었다. Copy number variation 분석을 이용한 엑손 결손의여부 예측에 있어 TruSeq Custom Amplicon은 100%, BRCATumor MASTR Plus은 88.9%, Ion AmpliSeq BRCA panel은40%의 민감도를 보였다. 특히 TruSeq Custom Amplicon은 9명의환자 중 8명에서 엑손 결손 범위까지 정확하게 예측하였다.결론: 본 연구에서는 NGS 기법을 이용한 유전자 패널은 우수한분석능을 지니고 있음을 확인하였다. 분석 알고리즘을 보완한다면Sanger sequencing 및 MLPA를 대체할 수 있을 것으로 판단된다.따라서 NGS 기반의 BRCA1/2 유전자 패널은 유전성 유방암 및난소암을 진단하는데 있어 유용한 검사 전략으로 ------주요어: 유전성 유방암·난소암, 차세대 염기 서열 분석법, 유전자패널, BRCA1, BRCA2학 번: 2014-21147ii
목차국문초록 .i목차 .iii표 목록 .iv그림 목록 .v약어 .vi서론 . 1연구 재료 및 방법 . 31. 연구대상 . 32. DNA 추출 . 33. Library Preparation and Targeted Sequencing . 44. 데이터 분석 . 4결과 . 91. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene . 92. Copy number variation analysis of BRCA1 gene . 11고찰 . 32참고문헌 . 36영문초록 . 38iii
표 목록Table 1. Patient list of three gene panel studies . 7Table 2. Analytic performance of sequence analysis usinggene panels . 15Table 3. False negative variant cases in gene panels . 16Table 4. False positive variant cases in gene panels . 17Table 5. Result of exon deletion prediction in gene panelstudies . tion using gene panel . 20Table 7. Prediction of exon deletion range using genepanel . 21iv
그림 목록Figure 1. Frameshift mutation of Patient S17 identified bygene panel . 22Figure 2. ROC curve of estimation of BRCA1 gene deletionby Z-score . 23Figure 3. Prediction of exon deletion in patient S01 . 24,25Figure 4. Prediction of exon deletion in patient S02 . 26,27Figure 5. Prediction of exon deletion in patient S03 . 28,29Figure 6. Prediction of exon deletion in patient S04 . 30,31v
약어CNVCopy number variationMLPAMultiplex ligation-dependent probe amplificationNGSNext-generation sequencingPCRPolymerase chain reactionvi
�계에따르면유방암및난소암은 여성에서 발생하는 암 중에 2번째, 10번째로 많은 발생자수는16,521명이었으며, 난소암 발생자수는 유전성인것으로보고되어있다(1). 유전성 유방암, 난소암의 원인 유전자 중 가장 대표적인것은 BRCA1 (17q21; OMIM *113705) 및 BRCA2 (13q12.3;OMIM *600185) 유전자이다. 이들 유전자는 유전성 케이스 중의15% 정도를 설명한다(2). 이들 유전자에서 돌연변이가 양성인경우, 일생 동안의 유방암 발병 확률은 50%-80%이며 난소암발병 확률은 20%-40% 이다(3-5).BRCA1 유전자는 23개 엑손으로 구성되어 있으며 크기는 5.6Kb 이다. 점돌연변이뿐만 아니라 엑손의 결손 및 중복도 발견된다.BRCA2 유전자는 27개 엑손으로 이루어져 있으며 크기는 ��고BRCA1유전자와는 달리 엑손의 결손 및 중복이 거의 관찰되지 않는다. 두유전자 모두 돌연변이가 호발하는 부위는 없는 것이 특징이다.현재까지 알려진 바로는 BRCA1 및 BRCA2 유전자에서 각각1706개 및 1446개의 돌연변이가 보고되어 전통적으로사용되어 온 검사방법은 Sanger sequencing이 일반적이다. 의결손 및-1-직접염기서열중복을확인하기
ication(MLPA) 또는 정량 PCR을 사용하고 있다. 해당 유전자들의 크기가큰 편이고, 엑손 개수도 많아 상기 검사법들은 시간 및 인력이 ��next-generationsequencing (NGS) 기법을 이용하려는 시도가 많이 ��분석을위해사용중인Sangersequencing을 대체할 수 있는 방법인 NGS 기반의 유전자 패널을임상적으로 적용해보고 유용성을 평가하고자 한다. 그 외에 엑손의결실 및 중복을 확인하기 위해 시행 중인 MLPA와 비교하여 유전자 패널의 임상적 적용 가능성을 검토하고자 한다.-2-
연구 재료 및 방법1. �자유전검사실로BRCA1및BRCA2 유전자 검사가 의뢰되었던 환자 중 잔여검체 활용에 동의한 경우만 포함하였으며, 돌연변이 양성인 50명을 선정하였다. 41명은 점돌연변이가, 나머지 9명은 엑손 결손이 확인된 경우였다. 기본적으로 해당 검사항목이 의뢰되면 해당 유전자의 모든 엑손에 대해Sanger sequencing 및 MLPA를 시행하였다. 다만 17명은 가족 내돌연변이가 확인된 경우라서 특정범위에 대한 분석만 시행한 ��학연구윤리심의위원회(institutional review board)에서 연구승인(IRB No. H-1511103-722)을 받았다.2. DNA 추출연구에 참여한 환자의 말초혈액을 EDTA 진공튜브에 채혈하였고,제조사의 지침을 따라 Puregene DNA purification kit (GentraSystems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 채혈한 anoDrop2000cSpectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA,USA)를 이용하여 DNA의 농도 및 순도를 확인하였다. DNA 순도-3-
는 A260/A280의 비율이 1.8에서 2.0사이임을 확인하고 검사를 시행하였다.3. Library Preparation and Targeted Sequencing본 연구에 사용된 유전자 패널은 3가지 종류였으며, 각 패널에 포함된 환자의 명단은 Table 1과 같다. 첫번째로 TruSeq CustomAmplicon (Illumina, San Diego, CA, USA)는 50명 환자 전체를대상으로 실험을 진행하였으며 MiSeq (Illumina, San Diego, CA,USA)을 이용하여 염기서열분석을 시행하였다. 두번째로 BRCATumor MASTR Plus (Multiplicom, Niel, Belgium)은 46명의 환자(9명의 엑손 결손 사례 포함)를 대상으로 실험을 진행하였으며MiSeq으로 염기서열분석을 시행하였다. 세번째로 Ion AmpliSeqBRCA1 and BRCA2 panel (Life Technologies, Carlsbad, CA,USA)는 30명의 환자 (5명의 엑손 결손 사례 포함)를 대상으로 하였고 Ion torrent PGM (Life Technologies, Carlsbad, CA, ararypreparation부터targeted sequencing까지의 전 과정은 제조사 지침에 따라 시행하였다.4. 데이터 분석4.1. Sequence analysis-4-
MiSeq에서 얻어진 기본 데이터를 MiSeq Reporter (Illumina) 및NextGENe software version 2.4 (SoftGenetics, State College,PA)를 이용하여 분석하였다. Genome Reference ConsortiumHuman genome build 37 (GRCh37)을 기준으로 맵핑을 하였다.BRCA1 및 BRCA2 유전자의 표준염기서열은 각각 NM 007294.3및 NM 000059.3을 기준으로 하였고, 분석범위는 엑손 codingregion 및 그 주변 20 bp까지 포함하였다. 1000 Genome database,dbSNP135 및 Exome Aggregation Consortium의 자료를 이용하여 다형성 여부를 확인하였다. 이미 보고되어 있는 돌연변이인지를확인하기 위해서는 Breast Cancer Information Core Database(BIC database; http://research.nhgri.nih.gov/bic/) 및 HumanGene Mutation Database (HGMD; http://www.hgmd.cf.ac.uk)를이용하였다.4.2. Copy number variation analysisBRCA1 유전자의 Copy number variation (CNV)를 파악하기 위해서 depth에 대한 자료를 표준정규분포를 이용하여 분석하였다.먼저 엑손 결손이 거의 없는 것으로 알려진 BRCA2 유전자에 대한평균 depth를 이용하여 투입된 핵산의 양을 보정하였다. 보정된BRCA1 유전자의 depth에 대한 데이터 중 엑손 결손이 없는 41명의 환자의 데이터를 표준정규분포화 하였고, 이를 기반으로 하여 나머지 9명의 환자 데이터의 표준정규분포 내에서의 위치를 확인하였-5-
다. 최종적으로 얻어진 각 엑손에 대한 Z-score를 분석하여 엑손결손의 유무 및 범위를 확인하였다. 보완적으로 인접한 2개 엑손의Z-score 평균값을 활용하여 결손 범위를 예측하는데 적용하였다.CNV 분석법에 대해서 IBM SPSS Statistics 22 (IBM, Chicago, IL,USA)를 이용하여 ROC 곡선을 그려 분석능을 평가하였다.-6-
Table 1. Patient list of three gene panel 9S30S31S32S33S34S35TruSeq RCA TumorMASTR SeqYYYYYNNNNYNNYYYYYNNYYYNYNYYYYYNNNNY
S36S37S38S39S40S41S42S43S44S45S46S47S48S49S50Total number ofpatient YYN504630-8-
결과1. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene키트 종류 및 분석 파이프라인과는 무관하게 Sanger sequencing결과와 달리 유전자 패널에서 추가로 보고된 BRCA2 유전자의염기변이가있었다.c.4563A G(rs206075;Variantallelefrequency, 99.96%), c.6513G C (rs206076; Variant allelefrequency, 56.28%) 및 c.7397T C (rs169547; Variant allelefrequency, 99.86%)가 해당 염기변이이다. 이는 유전자의표준염기서열인NM 000059.3과 달라서 위와 같이 보고된 것으로 염기변이 분석의통계에서는 제외하였다. 상기 3종류의 염기변이를 제외하고 �염기변이의개수는289개 였으며, 각 유전자 패널별로 대상이 되는 환자에 대해염기서열분석 결과의 일치도를 비교하였다.환자 S17의 경우 c.922 924delinsT를 원인 돌연변이로 ��에는c.922 923delAG가등재되어 있었다. 기존의 Sanger sequencing 결과로는 기보고된돌연변이인c.922 923delAG와c.924C T가서로반대편대립유전자에 존재하는 것인지 아니면 c.922 924delinsT인지를구분할 수 없었다. 이번 연구를 통해 얻어진 유전자 패널의 결과로c.922 924delinsT가 확실함을 실제로 확인할 수 있었다 (Fig. 1).-9-
1.1. TruSeq Custom �었다. MiSeq Reporter의 경우 검출한 염기변이는289개로 분석 민감도는 100%에 해당하며, 위양성 사례는 �사례가있어분석민감도는 99.7%에 해당하였다. 위음성 사례는 환자 S20의BRCA1 유전자에서 보고된 c.1511G A 였다 (Table 3). 해당염기변이의 allele frequency는 20% 미만이었다. 위양성 사례는환자 S15에서 보고된 c.468 469delTA 및 환자 S46에서 보고된c.3463dupG였다 (Table 4).1.2. BRCA Tumor MASTR ��우확인된검출한염기변이는 261개로 분석 민감도는 99.2%에 해당하였다. 위양성사례는 145건이었다 (Table 2). 위음성 사례는 2건으로 모두틀이동 돌연변이였으며, 환자 S33의 BRCA2 유전자 돌연변이인c.3744 3747delTGAG 및 환자 S40의 BRCA1 유전자 돌연변이인c.5496 5506delinsA였다 (Table 3). 이들 모두 20% 미만의allele frequency를 보여 검출되지 않았다. 위양성 사례 145건은모두 8종의 염기변이였으며, BRCA2 유전자에만 분포하고 있었다(Table 4). NextGENe의 경우 263개의 염기변이 중 262개를검출하여 99.6%의 분석 민감도를 보였다. 위음성 사례 1건은 환자- 10 -
S33의 BRCA2 유전자 돌연변이인 c.3744 3747delTGAG였으며,20%미만의 allele frequency로 인해 검출하지 못 했다. 위양성사례는 모두 133건으로 6종의 염기변이였으며, BRCA2 유전자에만분포하고 있었다.1.3. Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 ��은Ion확인된Reporter를사용하였다. 257개의 염기변이 중 255개를 검출하여 99.2%의분석 민감도를 보였다 (Table 2). 위음성 사례 2건은 환자 S17의BRCA1 유전자 돌연변이인 c.922 924delinsT 및 환자 S40의BRCA1 유전자 돌연변이인 c.5496 5506delinsA였으며, variantcalling의 오류로 인해 검출하지 못 했다 (Table 3). 위양성 사례는존재하지 않았다 (Table 4).2. Copy number variation analysis of BRCA1 geneMLPA에서 엑손 결손을 보인 환자는 총 9명이었다. ��석대상에서제외하였으며, 그 외의 범위인 엑손 2-23번에 대한 유전자 패널의엑손 단위의 결손에 대한 분석능을 평가하기 위해 ROC 곡선분석을 시행하였고 결과는 Fig. 2와 같다. 각 유전자 패널의 곡선아래 영역은 TruSeq 1.000, Ion AmpliSeq 0.998 및 Multiplicom0.987 순이었다.2.1. TruSeq Custom Amplicon50명의 환자들에 대해 BRCA2 유전자의 depth를 분석하였다.- 11 -
평균값은22.7%2519X, 결손이표준정규분포화를573X로 나타났으며, 전자의환자들의 �하였다.하여ROC곡선상에서 민감도와 특이도의 합이 가장 큰 지점은 각각 100% 2.55부터-2.61이었다. 일반적으로 많이 쓰이는 cut-off인 Z-score -3.0을적용하여 결손 여부 및 그 범위를 예측해보았다. 각 환자의 엑손결손 여부는 단 하나의 엑손에서라도 결손을 시사하는 소견이 있는경우를 양성으로 분류하였다. 분석 대상인 환자 50명 중 엑손결손을 시사하는 소견을 보인 환자는 12명이었다 (Table 5). 엑손결손 여부를 예측에 있어서의 분석능은 민감도 100% 및 특이도92.7%이었다 (Table 6). 9명의 환자 중 8명에서 결손 범위를정확하게 예측하는 분석능을 보였다 (Table 7). 각 사례별로확인해보면 환자 S01의 경우 엑손 2-23번의 결손이 정확하게확인되었다 (Fig. 3A). 환자 S02 및 S03의 경우 각각 엑손 1012번 및 엑손 17-18번의 결손이 정확하게 확인되었다 (Fig. 4A &5A). 하지만 환자 S04의 경우 엑손 7번과 9번이 cut-off를 약간상회하는 소견을 보여 결손 범위의 예측에 있어 일부 오차가있었다 (Fig. 6A). 오차를 보정하기 위해 인접한 2개 엑손의 Zscore 평균값을 산출하여, 해당 값이 -3 미만인 경우 인접 엑손이모두 결손 범위에 해당한다고 판정하였다. 이 결과를 결손 여부 및범위를 예측하는데 적용하였을 때, 9명의 환자에서 모두 정확한결과를 도출할 수 있었다.- 12 -
2.2. BRCA Tumor MASTR Plus46명의 환자들에 대해 BRCA2 유전자의 depth를 분석하였다.평균값은 6087X, 표준편차는 1288X로 나타났으며, 없는시행한BRCA1유전자의환자들의 �하였다.하여ROC곡선상에서 민감도와 특이도의 합이 가장 큰 지점은 각각 96.1%및 95.6%이었으며, 해당하는 Z-score의 범위는 -1.83부터 1.85였다. 앞서 분석한 바와 같이 Z-score -3미만을 cut-off를적용하여 실제 환자의 결손 여부 및 그 범위를 예측해보았다. 분석대상인 환자 46명 중 엑손 결손을 시사하는 소견을 보인 를예측에있어서의분석능은 민감도 88.9% 및 특이도 94.6%이었다 (Table 6). 9명의환자 중 결손 범위를 정확하게 예측한 사례는 없었다 (Table 7).각 사례별로 확인해보면 환자 S01의 경우 엑손 2, 3, 7, 10, 12,14-17, 19-22번의 결손만을 정확하게 예측하였다 (Fig. 3B).환자 S02에서는 결손이 정확하게 예측된 엑손이 없었다 (Fig. 4B).환자 S03의 경우 엑손 17번의 결손만이 정확하게 확인되었으며,환자 S04의 경우 엑손 2, 3, 7, 10번의 결손만이 정확하게 확인되어상당한 오차가 있었다 (Fig. 5B & 6B).2.3. Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel30명의 환자들에 대해 BRCA2 유전자의 depth를 분석하였다.평균값은 1746X, 표준편차는 126X로 나타났으며, 변동계수는 7.2%- 13 -
이었다. 이를 이용하여 BRCA1 유전자의 depth를 보정하였으며,결손이 없는 환자들의 데이터를 기반으로 하여 표준정규분포화를시행한 뒤 Z-score를 산출하였다. ROC 곡선상에서 민감도와특이도의 합이 가장 큰 지점은 각각 98.0% 및 99.4%이었으며,해당하는 Z-score의 범위는 -1.54부터 -1.68이었다. Z-score 3미만을 cut-off를 적용하여 실제 환자의 결손 여부 및 그 범위를예측했을 때, 분석 대상인 환자 30명 중 엑손 결손을 시사하는소견을 보인 환자는 2명이었다 (Table 5). 엑손 결손 여부를예측에 있어서의 분석능은 민감도 40.0% 및 특이도 100%이었다(Table 6). 5명의 환자 중 결손 범위를 정확하게 예측한 사례는1건이었다 (Table 7). 각 사례별로 확인해보면 환자 S01의 경우엑손 2, 3, 5, 7, 10, 13-23번의 결손이 정확하게 확인되었다 (Fig.3C). 환자 S02 및 S04의 경우 정확하게 결손이 예측된 엑손은없었다 (Fig. 4C & 6C). 환자 S03에서는 엑손 17-18번의 결손이정확하게 확인되었다 (Fig. 5C).- 14 -
Table 2. Analytic performance of sequence analysis using gene panelsTruSeq Custom AmpliconBRCA Tumor MASTR PlusIon AmpliSeqMiSeq reporterNextGENeMiSeq reporterNextGENeIon 2113399.666.32552099.2100.0Total variants reported289in Sanger sequencingTrue positive variants289False negative variants 0False positive variants 0Analytic sensitivity % 100.0PPV %100.0PPV, positive predictive value- 15 -
Table 3. False negative variant cases in gene panelsPatient GeneS17BRCA1S20BRCA1NT changec.922 924delinsTc.1511G AAA changep.Ser308*p.Arg504HisClassification Gene panel (Analysis platform)PathogenicIon AmpliSeq (Ion Reporter)VUSTruSeq (NextGENe)Multiplicom (Miseq Reporter)S33BRCA2 c.3744 3747delTGAG p.Ser1248Argfs*10 PathogenicMultiplicom (NextGENe)Multiplicom (Miseq Reporter)S40BRCA1 c.5496 5506delinsAp.Val1833Serfs*7 PathogenicIon AmpliSeq (Ion Reporter)NT, nucleotide; AA, amino acid; VUS, variant of uncertain significance- 16 -CauseVariant callingLow allele frequencyLow allele frequencyLow allele frequencyLow allele frequencyVariant calling
Table 4. False positive variant cases in gene panelsTotal numberof the patients11301330228302929275212653NT, nucleotideGeneNT changeGene panel (Analysis dupGc.468 469delTAc.1964C Gc.3869G Ac.68-7delTc.7504C Tc.8830A Tc.10121C Tc.1151C Tc.1964C Gc.2138A Tc.3869G Ac.4068G Ac.7504C Tc.8830A Tc.10121C TTruSeq (NextGENe)TruSeq (NextGENe)BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe)BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe)BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe)BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe)BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe)BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe)BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter)BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter)BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter)BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter)BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter)BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter)BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter)BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter)Amplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification errorAmplification error- 17 -
Table 5. Result of exon deletion prediction in gene panel studiesPatient S33S34S35YYYYYYYYYNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTruSeq RCA TumorMASTR PlusYNYYYYYYYNNNNNNNNYNNNNNNNNNNNNNNNNN- 18 -Ion N/ANNNNNN/AN/AN/AN/AN
NN/ANS49NNN/ANS50NNN/AN/AMLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification; N/A, notapplicable- 19 -
Table 6. Analytical performance of exon deletion prediction using gene panelTruSeq Custom BRCA TumorMASTR PlusAmpliconIonAmpliSeqTotal number of504630patient includedTrue positive982False negative013False positive320True negative383525Analytic sensitivity (%) 100.088.940.0Analytic specificity (%) 92.794.6100.0PPV (%)75.080.0100.0NPV (%)100.097.289.3PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value- 20 -
Table 7. Prediction of exon deletion range using gene panelTruSeq Custom BRCA TumorMASTR Plus*Amplicon*S011-232-232, 3, 7, 10, 12, 14-17, 19-22S0210-12 10-12NoneS0317-18 17-1817S041-132-6, 8, 10-132, 3, 7, 10S051-132-132, 3, 10S061-132-132, 3, 7, 10S071-132-132, 3, 7, 10, 12S081-132-132, 3, 7, 10, 12S091-132-132, 3, 10, 11* Exon 1 was not included in prediction of exon deletion rangePatient MLPAIon AmpliSeq*2, 3, 5, 7, 10, 13-23None17-18NoneNoneN/AN/AN/AN/AMLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification; N/A, not applicable- 21 -
Figure 1. Frameshift mutation of Patient S17 identified by gene panel- 22 -
Figure 2. ROC curve of estimation of BRCA1 gene deletion by Z-score- 23 -
Z-score(A) Z-score-4-6-8-10-120510ExonContinued.- 24 -
5ExonFigure 3. Prediction of exon deletion in patient S01, (A) TruSeqCustom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacenttwo exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1and BRCA2 panel.- 25 -
Z-score(A) .5-1-1.5-2-2.5-3-3.50510ExonContinued.- 26 -
5ExonFigure 4. Prediction of exon deletion in patient S02, (A) TruSeqCustom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacenttwo exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1and BRCA2 panel.- 27 -
Z-score(A) 3210-1-2-3-4-5-60510152025152025Exon(B) 32Z-score10-1-2-3-4-50510ExonContinued.- 28 -
(C) 32Z-score10-1-2-3-40510152025ExonFigure 5. Prediction of exon deletion in patient S03, (A) TruSeqCustom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacenttwo exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1and BRCA2 panel.- 29 -
-score-4-6-8-10-120510ExonContinued.- 30 -
Z-score(C) 1.510.50-0.5-1-1.5-2-2.5-3-3.50510152025ExonFigure 6. Prediction of exon deletion in patient S04, (A) TruSeqCustom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacenttwo exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1and BRCA2 panel.- 31 -
고찰본 연구에서는 NGS 기법을 이용한 유전자 패널이 Sangersequencing 결과에 비교했을 때 유사한 분석 민감도(99.2%100%)를 가지고 있음을 확인하였다. TruSeq Custom Amplicon의경우 제조자의 권장 분석 플랫폼인 MiSeq Reporter를 이용하면정확하게 일치하는 염기서열분석 결과를 얻을 수 있었다. BRCATumor MASTR Plus의 경우 NextGENe을 이용하여 분석할 경우가장 우수한 결과를 보였으나, 1건의 위음성 사례 및 다수의 위양성사례를 보여 분석 플랫폼의 최적화가 더 필요하다고 생각된다. IonAmpliSeq BRCA panel은 제조사의 권장 분석 플랫폼인 IonReporter를 사용하였을 때, 99.2%라는 분석 민감도를 보였고 이는위음성 사례 2건 때문이었다. 2건의 사례는 모두 indel이라는공통점이 있었으며, 분석 과정 중 variant calling에 문제가 있었던것으로 확인되었기에 이를 보완한다면 분석 민감도를 개선할 수있을 것으로 기대된다. 기타 다른 연구에서도 BRCA1/2 유전자패널이 Sanger sequencing에 비해 동등하거나 우월한 분석능을보였다고 보고된 바 S기법은대립유전자의분리가 필요한 경우 raw data를 확인하여 정확한 판독이 ��어려움이 많다. 하지만 NGS 기법은 각각의 amplicon read가하나의대립유전자를반영하기- 32 -때문에복잡한염기변이를
확인하는데 유용할 수 있다. Read length의 길이가 더 길다면structural variation까지도 분석할 수 있는 장점이 ��이용하여CNV를분석하였다. 표준정규분포를 이용하여 Z-score를 산출하였고, 이를통해 엑손 단위의 결손을 예측해보았다. ROC 곡선에서 얻어진곡선아래영역은 0.987-1.000으로 매우 우수한 분석능을 보였다.다만 이를 엑손 단위의 결손 예측이 아닌 환자 단위로 적용해야하기 때문에 실제 검사법으로서는 다소 낮아진 분석능을 보였다.3가지 유전자 패널 중 가장 우수한 분석능을 보인 것은 TruSeqCustom Amplicon이었으며 엑손 결손의 여부를 예측하는데 쓰이는유전자용량검사법인 MLPA를 시행하기에 앞서 선별검사로 적용하는데 적합한검사법임을의미한다. 선별검사없이 MLPA를 시행했을경우41건의 음성 사례를 모두 포함해야겠지만, 선별검사로 적용했다고가정하면 41건 중 위양성 사례는 단 3건이었기에 불필요한 MLPA시행 건수를 획기적으로 줄일 수 있을 것으로 예상된다. 상기기준만을 적용했을 때 9명의 환자 중 8명에서 정확한 결손 범위를예측하였고, 나머지 1명에서는 결손 범위 예측에 일부 오류가있었다.위에서 기술한 바와 같이 TruSeq Custom Amplicon은 엑손결손 예측에 있어 우수하지만 일부 오류를 내포하고 있었다. 이를보완하기 위해 인접한 2개 엑손의 Z-score 평균값을 산출하여추가로 적용하였을 때, 결손 여부 및 결손 범위 예측에 있어100%의 일치도를 확보할 수 있었다. 실제 검사실에서 CNV 분석을- 33 -
시행함에 있어 (1) 단일 엑손의 Z-score 수치로 결손 여부를판정하고, (2) 2개 이상의 연속된 엑손의 결손이 있는 경우 인접한2개 엑손의 Z-score 평균값으로 결손 범위를 예측한다면 MLPA를대체할 수 있을 것으로 예상된다.본 연구에서 다루어진 2가지 유전자 이외에도 유전성 유방암에관련된 여러 유전자들이 알려져 있다. p53 및 PTEN의 돌연변이는종양 증후군과 관련되어 있으며, 유방암 발병 위험도를 매우 높인다.그 외에도 CHEK2, ATM, NBS1, RAD50, BRIP 및 PALB2의돌연변이는 유방암 위험도를 2배 가량 높이는 것으로 보고되어있다(11). 이런 발병 위험도에 관련된 여러 유전자들을 한꺼번에평가한 연구보고가 있다(9, 12). 그 밖에도 항암화학치료 후 예후에대해 분석하여 유전적 특성을 규명한 연구보고도 있다(13, 14).이와 같이 BRCA1 및 BRCA2 유전자 이외에도 환자의 발병위험도 및 예후와 관련된 여러 유전자들이 보고되어 있으므로유전자 패널의 분석 범위를 확장하여 적용하는 것도 임상적으로중요할 것으로 생각된다.본 연구에서는 유전성 유방암 및 난소암 발병의 주요 ��검사방법인Sangersequencing을 대체할 수 있다는 가능성을 확인하였다. 더불어CNV 검출에 있어서도 유용한 정보를 획득할 수 있다는 사실도확인하였고, MLPA 시행에앞서 선별검사로 적용할 수있는가능성을 확인하였다. 앞으로 발병 및 예후와 관련된 유전자들을포함하여 패널로 활용한다면 임상적으로 유용한 정보를 한꺼번에제공할 수 있을 것이며, 이는 유전성 유방암 및 난소암의 진단 및- 34 -
�된다.- 35 -좋은기회가될것으로
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AbstractIntroduction: According to domestic statistics, breast and ovarian cancer are2nd and 10th most common cancer in females. Mutations of BRCA1 andBRCA2 gene increase the risk of hereditary breast and/or ovarian cancer inwomen five times. These genes have 5.6 Kb and 10.3 Kb size respectively,and have allelic heterogeneity without mutation hot spot. Thereforemutational analysis of BRCA1 and BRCA2 gene have been challenging. Theobjective of this study is to evaluate clinical usefulness of gene panel usingnext-generation sequencing for replacement of Sanger sequencing andMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA).Methods: This study enrolled 50 BRCA1 and BRCA2 gene mutation positivepatients (9 exon deletion cases and 41 point mutation cases), which wereconfirmed by Sanger sequencing and MLPA in Molecular DiagnosticsLaboratory, Seoul National University Hospital. We included 3 gene panels,which were as follows, TruSeq Custom Amplicon, BRCA Tumor MASTRPlus, and Ion AmpliSeq BRCA panel. We performed next-generationsequencing using MiSeq and Ion torrent PGM and compare the results withtraditional methods.Results: In comparison to Sanger sequencing, TruSeq Custom Ampliconrevealed 100% analytic sensitivity, BRCA Tumor MASTR Plus 99.6%, andIon AmpliSeq BRCA panel 99.2%. False positive variants were reported inonly BRCA Tumor MASTR Plus. With regard to prediction of exon deletionusing copy number variation analysis, TruSeq Custom Amplicon revealed 100%analytic sensitivity, BRCA Tumor MASTR Plus 88.9%, and Ion AmpliSeq- 38 -
BRCA panel 40%. Especially TruSeq Custom Amplicon estimated preciselyexon deletion range 8 of 9 patients.Conclusions: This study suggested gene panel using NGS technology haveexcellent analytical performance. If analytic algorithm is complementedappropriately, gene panel could replace Sanger sequencing. Furthermore genepanel provide useful information for prediction of CNV analysis. And it wasable to support the screening of gene dose analysis. Considering cost and timein addition to analytic performance, BRCA1/BRCA2 gene panel is useful teststrategy for diagnosis of hereditary breast and/or ovarian --------------------------------------Keywords: Hereditary breast and/or ovarian cancer, Next-generationsequencing, Gene panel, BRCA1, BRCA2Student number: 2014–21147- 39 -
TruSeq Custom Amplicon은 100%, BRCA Tumor MASTR . ii Plus는 99.6%, Ion AmpliSeq BRCA panel은 99.2%의 민감도를 보였다. 위양성 결과는 BRCA Tumor MASTR Plus에서만 133건 보고되었다. Copy number variation 분석을 이용한 엑손 결손의 여부 예측에 있어 TruSeq Custom Amplicon은 100%, BRCA Tumor MASTR Plus은 88.9%, Ion AmpliSeq BRCA panel은 40%의 .
